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β-胡萝卜素羟化酶(β-cryptoxylase)是一种非血红素双铁单加氧酶,催化植物中的β-胡萝卜素(β-carotene)经过中间产物β-隐黄素形成玉米黄素(zeaxanthin)。它广泛存在于植物、海生细菌、蓝藻等生物中。不同生物的β-胡萝卜素羟化酶基因(CHX)序列具有一定的保守性,特别是在高等植物和绿藻间该酶的保守性更高。多种生物的β-胡萝卜素羟化酶基因已被克隆并分别在细菌、蓝藻或植物中表达。本研究旨在克隆编码南丰蜜橘(Citrus reticulata Blanco var.kinokuni(Tanaka)H.H.Hu)β-胡萝卜素羟化酶的cDNA,并构建原核表达载体,包括以下部分:1提取幼嫩叶片的基因组DNA和总RNA。2设计一对带酶切位点的特异性引物进行RT-PCR(reversetranscription-polymerase chain reaction),回收纯化目的片段,克隆到pMD19-TSimple载体上,重组质粒pMD19-T-CHX被转化到大肠杆菌DH5α中培养,挑单菌落进行菌落PCR,筛选阳性克隆子提取质粒进行酶切鉴定并送检测序,测序结果与GenBank中已有的南丰蜜橘β-胡萝卜素羟化酶基因序列预测的cDNA进行比较,确认目的基因克隆正确。3对重组质粒进行双酶切,回收纯化目的片段后连接到原核表达载体pET-20b(+)上,重组质粒PET-CHX转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,进行抗性筛选、菌落PCR、酶切和测序鉴定,确认原核表达载体构建成功。4对β-胡萝卜素羟化酶的蛋白结构进行生物信息学分析。本实验成功克隆了编码南丰蜜橘β-胡萝卜素羟化酶的cDNA并构建了原核表达载体。生物信息学分析表明表明β-胡萝卜素羟化酶含311个氨基酸分子量为34.7854 kDa,pI值为9.03。该酶定位于类囊体膜上,TMpred跨膜分析显示它含有四个显著的跨膜螺旋区,这些区域与ProtScale预测的疏水区基本重叠。该酶二级结构以α-螺旋为主,且含多种磷酸化位点。