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利用突变体来克隆基因是功能基因组研究的重要策略,目前很多研究机构都在用各种方法创建突变体库,并且从突变体中分离到了很多重要的基因。本研究利用水稻中的一个反转录转座子Tos17创建水稻突变体库。Tos17是一个“复制-粘贴”型的转座子,在组培的情况下被激活产生新的拷贝插入到基因组中,而分化成植株后Tos17的转座活性消失,新的拷贝能稳定遗传。为了证明利用Tos17创建突变体来分离克隆基因的方法的有效性,本研究对Ti代家系进行了正向遗传学的筛选,目的是寻找与Tos17插入位点共分离的家系,为基因分离和克隆奠定基础。此外通过接头PCR的方法分离Tos17侧翼序列,不仅能更加深入的了解Tos17在水稻基因组中的分布,而且根据侧翼序列提供的基因信息,可以广泛的开展反向遗传学的研究。
主要研究结果如下:
1.共计产生独立的Tos17突变体15,543株。通过对Tos17拷贝数的Southern检测,发现中花11中Tos17原始拷贝数为4,经过三个月的组培时间,平均每株含有新Tos17插入拷贝1.4个,整个突变体库中约含有插入位点21760个。
2.利用接头PCR的方法和TAIL-PCR的方法分离到能精确定位到水稻染色体上的Tos17侧翼序列601条,其中非重复的侧翼序列为524条。
3.从侧翼序列的分析的结果来看,Tos17偏向于插入较大的染色体,插入数目和染色体的长度存在显著的正相关(r=0.717,P<0.01)。而在基因组区间内,我们发现Tos17显著偏爱于插入基因区(SR=10.85),而显著不偏爱于插入基因间隔区(-8.88)和转座因子相关区(-3.68)。在基因区域内,Tos17偏爱插入基因区(SR=4.55)而不偏向插入ATG上游1kb区(SR=-4.62)和翻译终止密码子下游500bp(SR=-3.25)这两个区。在基因编码区内,Tos17显著偏爱插入基因的外显子区域(SR=2.48)。
4.2008年夏季对Tos17插入突变体Ti代1,881个家系进行了筛选,结果显示整个田间有突变表型的频率为5.69%,主要突变表型有矮化、不育、白化、黄化、晚抽穗等。对10个家系中的12个插入位点进行了PCR验证,发现有10个Tos17插入位点是可以确认是正确的。