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[目的]应用皮质酮制作大鼠拟“衰老”胸腺细胞模型。研究补肾、益气方药对皮质酮致大鼠拟“衰老”胸腺细胞模型增殖、凋亡及免疫功能的调节作用,探讨其药理作用的分子机制。
[方法](1)大鼠拟“衰老”胸腺细胞模型的制作:采用24h SD乳鼠,应用高浓度(1×10-5M)皮质酮制作大鼠拟“衰老”胸腺细胞模型,并以D-半乳糖为模型对照进行原代胸腺细胞培养。采用MTT法观察细胞生长活性;按试剂盒说明书检测细胞β-半乳糖苷酶活性变化;PI染色结合流式细胞术(FCM)分析细胞周期分布;Annexin V-PI双染色法结合FCM检测胸腺细胞凋亡情况;以进行模型细胞的鉴定。(2)制备大鼠含药血清(补肾益气方,左归丸)。(3)实验分组:①空白对照组;②模型对照组;③补肾益气组;④左归组。(4)指标检测:MTT法检测药物对ConA诱导的胸腺细胞增殖情况;PI染色结合流式细胞术(FCM)分析细胞周期分布;AnnexinV-PI双染色法结合FCM检测胸腺细胞凋亡情况;Real time PCR和Western blotting法检测细胞增殖、凋亡、免疫相关因子的表达(mRNA和蛋白)变化。
[结果]1×10-5M皮质酮处理胸腺细胞后,与正常对照组比较,模型细胞透光度下降,密度降低;细胞活性下降,与D-半乳糖模型组比较无明显差异。1×10-5M皮质酮能显著抑制ConA诱导的胸腺细胞体外增殖(P<0.01),使胸腺细胞显著阻滞于G1期(P<0.01);胸腺细胞凋亡率显著升高,存活细胞数量显著减少(P<0.01); p16、caspase3、bax表达显著升高(P<0.01),cdk4、bcl-2/bax比值、IL-2、IL-2Rα蛋白表达降低(P<0.05)。与模型对照组比较,补肾、益气方含药鼠血清作用于模型细胞后,阻滞于G1期细胞数量减少,S期细胞数量升高(P<0.05);胸腺细胞凋亡率降低(P<0.05); p16、caspase3等基因、bax mRNA表达降低,IL-2表达、IL-2Rα蛋白表达、bcl-2/bax比值升高(P<0.05)。
[结论]
(1)采用1×10-5 M皮质酮可以用于制作大鼠拟“衰老”胸腺细胞模型。
(2)皮质酮能通过影响caspase3、bax的表达促进细胞凋亡,影响p16、CDK4的表达阻滞细胞周期于G1期,最终表现为IL-2、IL-2Rα等表达降低的胸腺依赖性免疫功能下降。
(3)补肾、益气方含药鼠血清能不同程度改善上述模型细胞各项指标的异常变化,提高胸腺依赖性免疫功能,延缓衰老。