不同理化条件及内生菌对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮体系细胞生物量和绿原酸含量产生的影响

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灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’为忍冬科忍冬属植物,是传统药用植物金银花的新品种之一,具有较高的药用价值。与传统的忍冬科植物相比,灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’产量较高、抗逆性较强等,更为重要的是其次级代谢产物绿原酸含量较高。而绿原酸作为金银花质量成分的主要指标,具有较高的生物药用活性,目前大多从植物源材料中提取,供不应求。本研究试图优化灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮体系理化条件,并向悬浮体系中添加不同的内生菌作为诱导子,以期提高绿原酸产量,为绿原酸的工业化生产打下基础。(1)优化灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮体系理化条件。以灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’为外植体,诱导并获得适宜的愈伤组织,建立适宜的悬浮体系。分析不同理化条件对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮体系生物量和绿原酸含量的影响,以期达到提高绿原酸含量的目的。实验结果表明:灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮体系最佳理化条件为:培养时间15d、p H为5.5、蔗糖量为30-40g.L-1、接种量为50 g.L-1、接种在全量B5培养基中。同时,对于附加的激素而言:单一激素中2.0mg.L-1的6-BA可以有效的提高‘渝蕾1号’悬浮体系生物量和绿原酸含量;而混合激素中,6-BA 2.0 mg.L-1+2,4-D 0.5 mg.L-1可以使绿原酸的积累最多,6-BA 2.0mg.L-1+2,4-D 2.0 mg.L-1可以使生物量达到最大。对于苯丙氨酸来说,当苯丙氨酸浓度大于50 mg.L-1时,均有利于绿原酸的积累。此外,无机盐对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮体系产生的影响表明,NO3-/NH4+摩尔比值为13:1时,有利于细胞的生物量和绿原酸的积累;KNO3在较高浓度(3.5 g.L-1)时,生物量可取得最大值,在较低浓度(0.5-1.5 g.L-1)时,积累的绿原酸较多;(NH4)2SO4浓度在0.268g.L-1时,绿原酸和生物量均取得最大值;0.1 g.L-1的Na H2PO4.2H2O和0.2 g.L-1的Ca Cl2均有利于细胞生物量和绿原酸的积累;对于Mg SO4.7H2O来说,低浓度有利于细胞的生长,高浓度促进绿原酸的积累,兼顾生物量和绿原酸的积累量,应选择适中的浓度。(2)内生菌对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮体系产生的影响。实验从‘渝蕾1号’外植体中分离纯化获得17种内生菌,并通过16S r DNA和18S r DNA分子鉴定结合形态特征鉴定出6株内生菌,分别是根瘤菌(cc2)、荧光假单胞菌(cc4)、盾壳霉菌(cc5)、高地芽孢杆菌(cc13)、同温层芽孢杆菌(cc14)以及短小芽孢杆菌(cc15)。研究表明,6种内生菌均不同程度的影响着‘渝蕾1号’悬浮体系生物量的含量和绿原酸的积累。对于生物量来说,6种内生菌浓度均在25mg.L-1时,生物量取得最大值。而对于绿原酸的积累量来说,根瘤菌、荧光假单孢菌、盾壳霉菌及同温层芽孢杆菌均在浓度为25mg.L-1时,绿原酸含量达到最大,而高地芽孢杆菌和短小芽孢杆菌在浓度为12.5mg.L-1时,绿原酸含量达到最大。综上所述,本研究对灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’悬浮体系理化条件进行了优化,并揭示了灰毡毛忍冬‘渝蕾1号’内生菌的种类及与次级代谢物绿原酸的关系。目的均在于提高绿原酸的产量,为绿原酸的工业化生产奠定基础。
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