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研究目的LRRK2是近年来受关注较多的一个帕金森病(PD)相关基因。是一个会导致遗传性帕金森病的最为常见的常染色体显性遗传帕金森病基因,可能导致了约7%家族遗传性帕金森病,它的突变与散发性PD也有一定的联系,遗传性突变引起的LRRK2激酶活性增高是目前比较公认的帕金森病发病机制之一,并正在指导着临床药物的开发。大黄素和槲皮素在我们实验室的前期实验已证明是在体外能有效抑制LRRK2激酶活性的具有激酶活性抑制作用的中草药制剂。本实验选用相应的转基因果蝇品系对大黄素和槲皮素进行进一步实验研究,检验其在体实验时有无激酶活性抑制作用,并选出作用最好的浓度值,进一步实验,研究其作用的途径。方法1.使用Ddc-GAL4;UAS-LRRK2-G2019S品系果蝇(简称GS2),给予不同浓度的大黄素和槲皮素,与对照组比较,检测生命周期和运动能力,筛选出合适的药物浓度,观察生命周期和运动能力出现重大变化的时间段,进入下一步实验。2.使用GS2品系果蝇作为实验组,Ddc-Gal4品系果蝇(简称GAL4)作为阴性对照组。饲养至一定时间,取果蝇头部,提取蛋白,用Western blot检测p-LRRK2、Nrf2、GCLC、p-p38MAPK、ERK、TH等表达的变化,确定大黄素和槲皮素提高LRRK2突变致PD果蝇的寿命和运动能力的可能途径。结果1.大黄素实验组:生命周期:浓度为100μmol/l的大黄素果蝇寿命延长最明显。并且40天左右曲线出现明显改变。半数生存时间显示浓度为100μmol/l的大黄素实验组有意义。运动能力:浓度为100μmol/l的大黄素果蝇的运动能力(攀爬)改善最明显,数据统计在第四、第五、第六、第七周有意义。在第六周意义更为明显。2.槲皮素实验组:生命周期:浓度为10μmol/l的实验组和浓度为1μmol/l的实验组的效果是有重合的,但在40天左右时,10μmol/l实验组的效果明显优于1μmol/l实验组。各组曲线均在40天左右出现明显改变。半数生存时间显示浓度为1μmol/l和10μmol/l的实验组数据都有意义。运动能力:浓度为10μmol/l的槲皮素实验组的效果最明显。数据统计在第三、第四、第五、第六周皆有意义,且在第六周意义更为显著。3.使用大黄素、槲皮素后磷酸化LRRK2的表达量降低;Nrf2和GCLC的表达量均有增加;磷酸化p38MAPK的表达量降低。ERK的表达量要低于未用药实验组。TH的表达量增高。结论1.给药浓度为100μmol/l的大黄素和10μmol/l的槲皮素的效果相对比较明显。生命周期和运动能力都是在40天左右,也即是在第六周时出现明显改变。2.大黄素和槲皮素可能是经由:通过激活Nrf2,引起Nrf2的核转移,继而提高GCLC基因表达,增加GSH的表达,产生抗氧化作用,提高细胞抗氧化应激的能力,保护了DA神经元功能,对PD起到一定的治疗作用。通过抑制p38MAPK的磷酸化,阻断JNK的活化,降低了LRRK2突变导致的激酶活性增高,保护DA神经元,对PD起到一定的治疗作用。