研究背景和目的结直肠癌是一种常见的消化系统肿瘤,在我国的发病率总体上呈逐年上升趋势[1]。近年来,虽然诊疗技术和化疗药物不断更新,极大的改善了结直肠患者的治疗效果,但由于大多数患者发现时已经发生转移,结直肠癌患者的预后仍然没有显著改善[2]。因此,积极开展结直肠癌转移相关机制研究,寻找新的分子标志物及治疗靶点并进行早期干预和个体化治疗,提高患者生存率具有重要的临床价值和社会意义。长链非编码RNA (long noncoding RNA, IncRNA)是一类长度大于200nt,缺乏开放读码框架的非编码RNA,主要从表观遗传学、转录调控及转录后调控等方面实现对基因表达的调控[3-5]。在结肠癌组织和细胞中,lncRNA调节增殖和转移的机制多种多样[6,7]。首先,lncRNA可调控染色体稳定性。HOTAIR与多梳蛋白复合物相互作用,对染色体进行重编程,促进结肠癌和乳腺癌的发生发展进程[8,9]；CCAT2在微卫星稳定的结直肠癌中高表达,并且维持染色体不稳定性,促进肿瘤生长和转移[10]。其次,lncRNA可作为转录激活或是转录抑制因子调控肿瘤相关基因的表达。lncRNA-RMST与Sox2组成复合物结合于转录因子的启动子区域,调节神经系统干细胞的干性维持[11]。然而,在野生型HCT116细胞中高表达lncRNA-ROR可降低p53蛋白的水平,提示ROR是强烈的p53蛋白抑制因子[12]。此外,lncRNA通过与多种信号通路的相互作用,调节肿瘤细胞的生物学行为。LncRNA-CCAL通过其靶蛋白AP-2 α调节结直肠癌的发展进程,并且激活Wntβ-catenin信号通路[13]；lncRNA-PVT1通过激活TGF-β通路和凋亡相关通路抑制肿瘤细胞的生长和浸润能力[14]。由此可见,lncRNA在多个层次上参与构成了重要的基因表达调控网络,精细调节肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡,参与了肿瘤发生发展和浸润转移的全过程。Kretz等发现在人类分化成熟的皮肤组织中发现终末诱导分化长链非编码RNA-TINCR (Terminal differentiation-induced lncRNA, TINCR)高表达,并且TINCR可与Stau1蛋白结合维持分化相关基因mRNA的稳定性,从而诱导组织正常分化[15,16]。但是同时还发现在干扰TINCR时,一些基因的mRNA水平上升,提示TINCR可能通过其他机制发挥其功能。目前关于TINCR在结直肠癌增殖转移过程中的作用及机制研究较少,我们证实：LncRNA-TINCR在结直肠癌组织中低表达,且与肿瘤恶性生物学行为呈负相关；功能实验结果表明,在结肠癌细胞中下调TINCR可促进癌细胞发生浸润和转移。本课题拟在此基础上,进一步探讨TINCR在结直肠癌增殖转移过程中的作用及机制,为肿瘤增殖转移的临床诊断、治疗及预后评估提供新靶点并奠定理论基础。研究方法1. TINCR在结直肠癌组织及细胞中的表达生物信息学预测TINCR在结直肠癌组织中的表达；采用实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测44对结直肠癌组织及其对应癌旁组织中TINCR的表达；RT-qPCR检测结直肠癌细胞株SW480,HCT116,HT29,LS174T,SW620,RKO及LoVo中TINCR的表达；RT-qPCR分别检测SW480,HCT116细胞核及细胞质中TINCR的表达。2. TINCR抑制结直肠癌增殖、浸润和转移(1)设计TINCR shRNA片段,并包装入慢病毒,构建TINCR稳定干扰慢病毒载体,并转染至SW480,HCT116细胞,构建成TINCR稳定干扰细胞株HCT116/shTINCR和SW480/shTINCR。(2)设计TINCR引物,PCR扩增TINCR全长,基因克隆至pcDNA-3.0载体中,并转染RKO,LoVo细胞,G418筛选,构建TINCR稳定过表达细胞株RKO/oeTINCR和LoVo/oeTINCR。(3)通过CCK8,平板克隆形成,裸鼠皮下成瘤实验检测各组肿瘤细胞增殖能力；通过划痕损伤愈合实验,Transwell迁移实验检测各组细胞迁移能力；通过Tranwell侵袭实验和裸鼠尾静脉注射实验检测各组细胞浸润转移能力。3. TINCR与EpCAM特异结合并调节其水解(1)HCT116及SW480细胞中敲除TINCR后,采用RT-qPCR, Western blot检测结直肠癌细胞中EpCAM mRNA及蛋白水平的表达。(2) Western blot检测HCT116及SW480细胞中敲除干扰TINCR后,细胞中EpCAM蛋白半衰期的改变。(3) RNA pull down, RNA immunoprecipitation检测HCT116及SW480细胞中TINCR与EpCAM的结合。(4)构建Psen2过表达载体,分别转染入HCT116/shTINCR, HCT116/oeTINCR细胞,Western blot分析各组中EpCAD及EpICD蛋白表达情况。(5)免疫组织化学及Western blot检测结直肠癌组织中EpCAM胞内片段EpICD的表达,分析TINCR表达与EpICD表达的相关性。4. TINCR低表达促进结直肠癌中Wnt/p-catenin通路激活(1)扩大培养并抽提TOP,FOP载体,随后转染至HCT116/shTINCR, SW480/shTINCR及相应对照组细胞中,荧光素酶报告系统Wnt/β-catenin通路的激活情况。(2)HCT116及SW480细胞中敲除TINCR后,收集蛋白及mRNA,利用Western blot, RT-qPCR检测Wnt/β-catenin相关蛋白及：mRNA的表达情况。(3) co-IP检测HCT116/shTINCR及SW480/shTINCR细胞中EpICD与β-catenin的结合。5. c-Myc通过抑制Spl转录活性降低TINCR的表达(1)利用生物信息学方法,通过UCSC, ESEMBLE等网站预测TINCR启动子序列及可与之结合的相关转录因子。(2)构建转录因子Spl过表达载体,转染入HCT116及SW480细胞中,RT-qPCR检测TINCR的表达；扩增包含Spl结合位点的启动子片段,并连接入pGL3-basic载体中,同时对结合位点进行点突变,得到突变载体。在HEK293,SW480及HCT116细胞中共转染Spl表达载体和TINCR双荧光素酶报告载体,采用双荧光素酶报告系统检测转录因子Spl对TINCR启动子的激活作用。(3)ChIP实验检测Spl与TINCR启动子的直接结合。(4)将Sp1过表达载体,转染入HCT116及SW480细胞中,RT-qPCR检测TINCR的表达；c-Myc及Sp1表达载体共转染HCT116及SW480细胞中,RT-qPCR检测TINCR的表达。研究结果1. TINCR在结直肠癌组织及细胞中的表达(1) TINCR在结直肠癌组织中表达下调并与肿瘤恶性生物学行为密切相关。生物信息学预测在Oncomine数据库中,与对照组相比,TINCR低表达于结直肠癌组。荧光定量RT-qPCR检测结果显示：相对于对应的癌旁组织,44对结直肠癌组织中TINCR表达显著下调(P<0.05)；临床病理分析结果显示：TINCR的表达与肿瘤的浸润深度,淋巴结转移及TNM分期呈负相关关系(P<0.05),而与肿瘤细胞的分化程度呈正相关关系。TINCR的表达与肿瘤患者年龄、性别及肿瘤大小无明显相关性(P>0.05)。(2)结直肠癌细胞株中TINCR的表达。荧光定量RT-qPCR检测TINCR在SW480,HCT116,HT29,SW620,RKO,LoVo及LS174T等7株细胞中的表达,结果显示,以LS174T为参照,恶性程度较高的SW620,RKO,LoVo细胞中TINCR表达显著低于恶性程度较低的SW480,HCT116,HT29细胞(P<0.05)。(3)核浆分离后,RT-qPCR检测TINCR在结直肠癌细胞中的定位。分离SW480,HCT116的细胞浆及细胞核提取物后,采用RT-qPCR分别检测其中的TINCR表达,结果发现：TINCR在细胞浆中的表达显著高于细胞核,提示TINCR可能主要表达于细胞浆。2. TINCR抑制结直肠癌增殖、浸润和转移(1)成功构建TINCR稳定干扰细胞株,SW480/shTINCR,HCT116/shTINCR及其相对应的对照组(Normal Control,NC)。与NC组相比,SW480/shTINCR, HCT116/shTINCR细胞中TINCR表达显著下调(P<0.05)。成功构建TINCR稳定过表达细胞株,RKO-TINCR,LoVo-TINCR及其相对于的转染空载的阴性对照组(Vector)。与Vector组相比,TINCR在RKO/oeTINCR, LoVo/oeTINCR组中表达显著上调(P<0.05)。(2)CCK8增殖实验表明：与NC组相比,干扰TINCR表达的SW480/shTINCR, HCT116/shTINCR组细胞增殖能力显著增强(P<0.05)；而与Vector组相比,过表达TINCR的RKO/oeTINCR, LoVo/oeTINCR组细胞增殖能力显著下降(P<0.05)。平板克隆实验得出结果与之相似。(3) Transwell迁移实验结果表明：干扰TINCR表达的SW480/shTINCR, HCT116/shTINCR组细胞迁移数量明显增多；而与Vector组相比,过表达TINCR的RKO/oeTINCR, LoVo/oeTINCR组细胞迁移数量显著下降(P<0.05)。划痕损伤愈合实验结果显示,与对照组相比稳定干扰TINCR的细胞株迁移速度明显加快；而TINCR过表达细胞株细胞迁移的速度则显著慢于Vector组。(4)裸鼠皮下成瘤实验结果表明：与NC组相比,稳定干扰TINCR表达的HCT116/shTINCR组肿瘤细胞生长增殖能力显著增强(P<0.05),肿瘤体积显著增大(P<0.05)；免疫组织化学显示HCT116/shTINCR组ki67增殖指数显著高于NC组(P<0.05)。(5)裸鼠尾静脉注射实验表明：与NC组相比,干扰TINCR组肿瘤细胞肝肺转移能力显著增强(P<0.05),5只实验组裸鼠均发生肺转移,4只实验组裸鼠发生肝转移；而对照组中只有1只发生肺转移,没有发生肝转移。3. TINCR与EpCAM特异结合并调节其水解(1) RT-qPCR检测HCT116及SW480细胞中敲除TINCR后EpCAM mRNA表达情况,结果发现干扰前后EpCAM mRNA表达水平没有显著统计学意义；Western blot结果显示：干扰TINCR表达后,EpCAM蛋白水平显著降低。(2) Western blot检测干扰TINCR前后,HCT116, SW480细胞中EpCAM蛋白半衰期的改变,结果显示,干扰TINCR后,细胞EpCAM蛋白半衰期显著降低。(3) RNA pull down实验结果显示：TINCR可与EpCAM蛋白特异结合；而RNAimmunoprecipitation结果显示：EpCAM蛋白可与TINCR特异结合。(4) Western blot结果显示：干扰TINCR后,EpCAM蛋白表达显著降低,而EpICD蛋白显著增加;在NC和HCT116/shTINCR组中,过表达Psen2后,EpCAM蛋白表达显著降低,而EpICD蛋白显著增加,而同时在共转染oeTINCR载体后,可部分抵偿这种结果。(5) Western blot及免疫组织化学检测结直肠癌组织中EpICD表达,结果发现：EpICD在肿瘤组织中的表达显著高于相应癌旁组织(P<0.05)；Sperman等级相关性分析结果表明：结直肠癌组织中TINCR表达与EpICD的表达呈显著负相关(P<0.02,r=-0.478)。4. TINCR低表达促进结直肠癌中Wnt/β-catenin通路激活(1)将TOP/FOP质粒转染入NC组细胞及HCT116,SW480干扰TINCR表达的细胞株后,荧光素酶报告系统结果显示：相对于NC组,在HCT116/shTINCR及SW480/shTINCR细胞中,TOP/FOP活性显著增强(P<0.05),提示Wnt/β-catenin通路激活。(2)收集NC组及HCT116/shTINCR及SW480/shTINCR细胞的mRNA及蛋白,RT-qPCR结果显示：Wnt/β-catenin通路相关基因β-catenin,TCF4,c-Myc等mRNA表达水平上调(P<0.05)。Western blot结果显示Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin,TCF4,c-Myc等表达上调。(3) co-IP结果显示：相对于NC组,在HCT116/shTINCR 及 SW480/shTINCR细胞中EpICD与β-catenin的结合增多。5. c-Myc通过抑制Sp1转录活性降低TINCR的表达(1)通过UCSC, ESEMBLE等网站成功预测TINCR启动子序列为其转录起始位点上游-1至-1473区域；将阈值设置为95%时,JASPAR, PROMO预测TINCR启动子上结合的转录因子为Sp1,结合位点位于1222bp至1232bp区域。(2)扩增TINCR启动子上包含Sp1结合位点片段并将其克隆至pGL3-basic载体上,形成pGL3-wt载体；同时将Sp1结合位点进行突变,形成pGL3-mut载体。构建转录因子Sp1过表达载体。分别将pGL3-basic, pGL3-wt, pGL3-mut载体与Sp1表达载体共转染至HEK293A,HCT116及SW480细胞,检测其荧光素酶活性。结果显示：与pGL3-basic组相比,三组细胞中Sp1均可以显著增加pGL3-wt组的荧光素酶活性(P<0.05,P<0.05,P<0.05),而pGL3-mut组荧光素酶活性没有明显改变(P>0.05,P>0.05,P>0.05)。ChIP结果也显示Spl可与TINCR启动子结合。(3)将Spl过表达载体,转染入HCT116及SW480细胞中,RT-qPCR检测TINCR的表达,结果显示：与对照组相比,过表达Sp1组中,TINCR表达显著增加(P<0.05)；而同时过表达Sp1及c-Myc时,TINCR表达水平较过表达Sp1组显著降低(P<0.05)。结论1. TINCR在结直肠癌组织中表达下调；TINCR低表达与结直肠癌浸润深度、淋巴结转移及TNM分期呈负相关,而与肿瘤分化程度呈正相关；在恶性程度较高的细胞株中TINCR表达降低,在恶性程度低的细胞株中TINCR表达升高。初步推断：TINCR在结直肠癌中可能起抑癌基因的作用。2. TINCR显著抑制肿瘤细胞的增殖能力、侵袭转移能力；结直肠癌中TINCR表达缺失,促进肿瘤细胞增殖,侵袭和转移。3. TINCR与EpCAM特异结合,并调节其蛋白水解。结直肠癌中TINCR低表达,促进EpCAM蛋白水解,释放胞内片段EpICD。4.结直肠癌细胞中低表达TINCR激活Wnt/β-catenin通路。5. c-Myc抑制转录因子Spl的转录活性,从而抑制TINCR的表达。