赤霉素（Gibberellins,GAs）是一种高效的植物生长调节剂,具有促进茎的伸长、打破休眠、诱花促果等作用。水稻恶苗病原菌藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）可生产多种高活性的赤霉素,但是目前工业化生产的发酵水平不高。通过对藤仓赤霉赤霉素生物合成途径中的基因进行研究,有助于赤霉素高产工程菌株的构建。利用同源重组对目的基因进行基因敲除,是研究丝状真菌基因功能的主要手段。本研究建立了一种基于重叠延伸PCR技术构建大片段、以藤仓赤霉原生质体为受体的基因同源重组敲除体系,并将该体系应用于藤仓赤霉p450-3基因的敲除。用几种真菌细胞壁降解酶进行了赤霉菌原生质体的制备,初步探索出了高效的藤仓赤霉原生质体制备方法:细胞壁降解酶Driselase和Yaterlase比例3:7,酶浓度15mg/mL,37℃酶解3h可达到最佳效果。1g新鲜藤仓赤霉菌丝可得到浓度约为5.13×10⁷个/mL的原生质体。对重叠延伸PCR技术进行了优化,成功将藤仓赤霉p450-3基因800 bp上下游同源序列和中间1860 bp潮霉素抗性序列连接成3460bp的大片段。PCR程序为:94℃预热2min;94℃变性30s,58℃退火10min,72℃延伸5min,35个循环;72℃最终延伸10min。利用CaCl₂-PEG介导的方法将p450-3敲除大片段成功转化藤仓赤霉原生质体,最终两批次转化共得108个转化子,转化率约为56个/μg DNA。对转化子进行抗性稳定性检测,得到93个有稳定潮霉素抗性的转化子。以PCR方法鉴定出的27个转化子中,随机挑取7个转化子（T3、T5、T9、T10、T23、T27、T34）进一步以Southern blot、RT-PCR鉴定,结果表明其中5个为p450-3敲除株（T5、T10、T23、T27、T34）,2个为假阳性（T3、T9）。对藤仓赤霉野生型和基因敲除株在菌株表型和赤霉素生产能力方面进行了研究。结果发现:基因敲除株较野生型菌株在PDA平板上生长速率差异不显著,但在菌丝形态上有可见的区别。敲除株在显微镜下多为菌丝碎段且粗细极不均匀。表明p450-3基因的缺失会在一定程度上影响菌丝的生长发育,导致藤仓赤霉菌丝更加脆弱易碎。在赤霉素生产能力方面,野生型产量为GA₃ 400mg/L、GA₄ 102mg/L、GA₇ 488mg/L;p450-3基因敲除株不产生GA₃,同时也不产生GA₄和GA₇。可推测p450-3极有可能作为多功能基因牵涉赤霉素生物合成途径中更为复杂的催化步骤,而不只是催化GA₇至GA₃的步骤。对经过PCR鉴定的20株转化子和经过Southern杂交鉴定的5株p450-3基因敲除转化子进行了赤霉素发酵检测,结果表明:11株转化子不产生GA₃、GA₄、GA₇;14个转化子赤霉素效价与野生型无显著性差异。本研究为藤仓赤霉基因敲除体系的建立、赤霉素高产工程菌株的构建、赤霉素生物合成途径中基因功能的深入解析提供了参考依据。