禽流感(Avian influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引发的一种感染或疾病综合征，家禽感染AIV后，有的不表现出临床症状，有的表现为产蛋下降和呼吸道疾病，甚至导致全身性疾病，死亡率可达100％。因此，根据致病性高低将禽流感分为低致病性禽流感(Low pathogenic avian influenza，LPAI)和高致病pathogenic性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)。H9N2亚型禽流感病毒作为全世界流行最广泛的低致病性禽流感病毒之一，其对家禽生产和人类健康的影响El趋严重，逐渐成为流感病毒监测的焦点之一。
　　本研究做了H9N2亚型禽流感病毒的序列分析，M2蛋白的原核表达载体构建，H9N2亚型禽流感一新域疫(La Sota)二联灭活疫苗的试制三个方面的工作，以期为后续H9N2亚型禽流感病毒的研究打下基础。
　　1.1株H9N2亚型禽流感病毒的全基因克隆与序列分析
　　本研究提取了禽流感病毒分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017的RNA作为模板，反转录为cDNA。通过RT-PCR方法从该禽流感分离株cDNA扩增该毒株的8个vRNA全长片段，并克隆至载体pMD-18T中。经测序得到分离株的全基因序列，证实为H9N2亚型禽流感病毒，并对其氨基酸变异、抗原性、遗传进化关系进行分析。结果显示，分离株是一株由H9N2亚型禽流感病毒A/Duck/Hong Kong/Y439/97亚系毒株提供NS基因，其余基因片段由H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Shanghai/F/98亚系毒株提供的重组H9N2亚型禽流感病毒。
　　2.H9N2亚型禽流感病毒M2蛋白原核表达载体的构建
　　本研究提取了禽流感病毒分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017(H9N2)RNA作为模板，反转录为cDNA。通过RT-PCR方法从该禽流感分离株cDNA扩增得到该毒株的M2基因。并克隆至载体pET-28a中。经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切和测序证实后，再转化至表达菌E.coli.BL21。最终成功构建了M2基因重组原核表达载体并建立了M2蛋白的原核表达系统，为进一步研究M2蛋白的生物学活性奠定了基础。
　　3.H9N2亚型禽流感、新城疫经典毒株二联灭活疫苗的试制
　　为研制H9N2亚型禽流感-新城疫经典毒株二联灭活疫苗，并评价其对鸡的免疫效果，本章节试验利用第二章节H9N2亚型禽流感分离株A/chicken/Shandong/LY1/2017和新城疫经典La Sota株制备了禽流感(H9N2)灭活疫苗、新域疫(La Sota)灭活疫苗、禽流感(H9N2)-新城疫(La Sota)二联灭活疫苗。制备时按照《中华人民共和国兽药典》要求进行毒株EID50检测、HA检测、抗原的灭活检验、疫苗的乳化检验。研究中选取21日龄非免鸡为试验动物，分成4组分别免疫AI灭活疫苗、ND灭活疫苗、AI-ND二联灭活疫苗，设立空白对照组。42日龄时进行一次加强免疫。在初免后2l天和加强免疫后7天对各组翅静脉采血，分离血清检测各组血清中AI HI抗体效价和ND HI抗体效价。二免后10天分离培养各组鸡脾脏淋巴细胞并选用LPS、PHA刺激，采用MTT方法检测各组淋巴细胞增殖能力。同时通过抗原刺激脾脏淋巴细胞后获取细胞上清进行IL-4、IFN-γ细胞因子的检测。结果显示，毒株EID50、HA效价，制成疫苗的无菌检验、乳化检验均符合《兽用生物制品质量标准》(2012)。在HI抗体水平检测中，AI灭活疫苗和AI-ND二联灭活疫苗在加强免疫后均能刺激机体产生很高的、无显著差异的AI HI抗体效价，均高于10log2:ND灭活疫苗和AI-ND二联灭活疫苗在加强免疫后机体ND HI抗体效价为7log2。分离脾脏淋巴细胞培养后。各实验组脾脏分离淋巴细胞的增殖能力无显著差异，但均高于空白对照组。IFN-γ细胞因子表达水平各组之间无显著差异，但实验组的IL-4细胞因子表达水平比对照组有轻微提升。综上，试验中研制的Al(H9N2)-ND(La Sota)二联灭活疫苗能够提供和禽流感(H9N2)灭活疫苗、新城疫(La Sota)灭活疫苗同水平的保护性HI抗体，并能无差异的提升淋巴细胞增殖能力，轻微提高淋巴细胞IL-4细胞因子的表达。禽流感(H9N2亚型)-新城疫(La Sota)二联灭活疫苗能够提供有效的免疫效果，其研制初具成效。