一、研究背景和目的近年来,随着经济全球化进程的加快,食品安全已成为当今世界性公共卫生热点。食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因,对人类健康造成极大危害,是食品安全的重大隐患。随着经济发展和技术进步,食源性疾病并未减少或消失,世界范围内食品安全恶性事件反而接连发生,食品安全形势严峻。目前,食源性致病菌的检测存在特异性差、操作繁琐、耗时,以及不能现场应用等问题。本研究旨在建立阪崎肠杆菌(Enterobacter Sakazakii)和痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)两种常见食源性致病菌的快速检测方法。阪崎肠杆菌是一种重要的食源性致病菌,呈世界性分布,主要通过婴幼儿配方奶粉经消化道感染儿童,引起新生儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎,甚或遗留神经系统后遗症或导致死亡。目前,引起阪崎肠杆菌感染事件的发生规模呈明显上升趋势,已成为我国重要的食源性致病菌。国际食品微生物标准委员会于2002年将阪崎肠杆菌列为对特定人群产生严重的生命危害或产生慢性后遗症的微生物。国家质检总局于2005年8月颁布了检测阪崎肠杆菌的行业标准SN/T1632.1。2006年,针对婴幼儿配方乳粉受阪崎肠杆菌污染的高风险性和污染后的巨大危害性,国家质检总局颁布了婴幼儿配方乳粉中阪崎肠杆菌每批必检的市场准入要求。检测阪崎肠杆菌的传统方法步骤繁琐,一般须耗时6d左右,近年来国内外相继建立了ELISA、PCR、核酸杂交等检测技术。痢疾志贺菌是人和动物肠道内寄生的革兰阴性无芽胞杆菌,是一类具有较强传染性、危害严重的革兰阴性肠道致病菌,所致的细菌性痢疾(Shigellosis)是世界上尤其是发展中国家重要的传染病之一,全球每年细菌性痢疾病例高达1.65亿,其中1.63亿发生在发展中国家,并导致110万患者死亡,其中60%以上为5岁以下儿童。近年来,痢疾志贺菌食物中毒的发生规模呈明显上升趋势,成为我国首要的食源性致病菌之一。目前,我国常用的志贺氏菌的检验方法主要是国标法(GB/T4789.5-2003)。整个检测程序需要3-5d完成,检测时间长,检出限为104CFU/mL。免疫学方法简单,但灵敏度不高；PCR方法具有灵敏、快速等优点,但检测成本较高,仪器昂贵,不适于基层单位推广应用。综上,建立准确、灵敏、操作简便、不依赖昂贵仪器的检测方法对于食源性致病菌感染的诊断、疾病控制和流行病学调查具有重要意义；发展快速准确、操作简便的检测与鉴定阪崎肠杆菌和痢疾志贺菌的方法成为相关研究的热点。目前,常用快速检测方法主要有ELISA、DNA探针、常规PCR、Real-time PCR等。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一种新颖的核酸扩增技术,依赖于能够识别靶DNA上6个特定区域的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下高效扩增核酸,具有高特异性、快速、灵敏、操作简便等特点。自从2000年以来,LAMP技术在临床疾病的诊断、病原性细菌或病毒的定性检测以及动物胚胎性别鉴定等方面应用广泛。LAMP技术在国内起步较晚,应用LAMP技术检测阪崎肠杆菌和痢疾志贺菌在国内外文献中报道较少。本研究针对阪崎肠杆菌外膜蛋白OmpA基因和痢疾志贺茵ipaH基因,分别设计相应的LAMP引物,建立优化的反应体系,考察特异性和灵敏度,并应用于食品样品的直接检测,初步建立阪崎肠杆菌和痢疾志贺菌的LAMP检测方法。二、研究方法1.阪崎肠杆菌LAMP快速检测技术的建立与初步应用(1)阪崎肠杆菌LAMP检测技术的建立根据GenBank公布的阪崎肠杆菌外膜蛋白OmpA基因序列(Accession number:DQ000206)的保守区,利用LAMP专用软件Primer Explorer version4设计一套特异性引物,即外引物F3和B3、内引物BIP和FIP,以阪崎肠杆菌(ATCC29544)提取的DNA为模板,建立检测阪崎肠杆菌的LAMP检测技术体系,并对反应体系内各反应条件进行优化,最终摸索出优化后检测阪崎肠杆菌的LAMP反应体系。(2)阪崎肠杆菌LAMP灵敏度、特异性实验和实际样品检测利用建立的LAMP方法检测阪崎肠杆菌纯培养物,考察其灵敏度。将过夜培养的阪崎肠杆菌(ATCC29544)菌液10倍倍比稀释至10-1～10-8,取各稀释度菌液100ul进行平板计数。同时取各稀释度菌液1ml提取DNA,取2ul上清液作为模板进行LAMP扩增和PCR扩增,测试两种方法检测阪崎肠杆菌纯培养物的灵敏度。选取3株阪崎肠杆菌标准菌株和大肠埃希菌、伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌等12株其它非阪崎肠杆菌致病菌进行特异性实验,检测LAMP方法的特异性。依据本实验所建立的LAMP和PCR的条件和参数,对36份奶粉样品进行检测,并与FDA检测方法进行比较。2.痢疾志贺菌LAMP快速检测技术的建立与初步应用(1)痢疾志贺菌LAMP检测技术的建立根据GenBank公布的痢疾志贺茵ipaH基因序列(Accession number:M76445)中的保守区作为靶序列,设计痢疾志贺菌特异性引物,包括外引物F3和B3、内引物BIP和FIP、环引物LF和LB。以痢疾志贺菌(CMCC48097)提取的DNA为模板,建立检测痢疾志贺菌的LAMP检测技术,并对反应体系内各反应条件进行优化。最终得出优化后检测痢疾志贺菌的LAMP反应体系。(2)痢疾志贺菌灵敏度、特异性实验和实际样品检测采用建立的LAMP方法检测痢疾志贺菌纯培养液,考察其灵敏度。将过夜培养的痢疾志贺菌(CMCC48097)菌液10倍倍比稀释至10-1～10-8,取各稀释度菌液100ul进行平板计数。同时取各稀释度菌液1ml提取DNA,取2μl上清液作为模板进行LAMP扩增和PCR扩增,测试两种方法检测痢疾志贺菌纯培养物灵敏度。同时选取4株志贺菌标准菌株和大肠埃希菌、伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌等其它非志贺菌进行特异性实验,检测LAMP方法的特异性,初步应用于人工污染猪肉样品痢疾志贺菌的检测,并与常规PCR方法比较。三、结果1.确定阪崎肠杆菌LAMP优化反应体系为：6mM MgCl2,0.6mMdNTPs,0.8M betaine,0.4μM外引物(F3和B3),1.6μM内引物(FIP和BIP),8U的Bst DNA聚合酶,2.5μl Thermopol buffer,2μL DNA模板,ddH2O补足体积至25μl；扩增温度58℃,反应60min,产物于2%琼脂糖凝胶电泳分析,得到典型的LAMP梯形条带,肉眼观察反应副产物焦磷酸镁白色沉淀。LAMP法能检出所有的阪崎肠杆菌菌株,产生特异性扩增的梯形条带,直接用肉眼观察到焦磷酸镁白色沉淀,而其它肠道致病菌均未产生特异扩增的梯形条带。LAMP对阪崎肠杆菌纯菌液检测灵敏度为2.0×101cfu/mL,PCR检测灵敏度为2.0×102cfu/mL; LAMP检测的灵敏度是传统PCR灵敏度的10倍,检测时间缩短了2-3h。采用LAMP法检测36份奶粉样品,其中2份样品检出阪崎肠杆菌,阳性率为5.6%,与FDA方法检测结果一致。2.确定痢疾志贺菌的LAMP反应体系为：5mM MgCl2,0.3mM dNTPs,0.6M betaine,0.4μM外引物(F3和B3),1.6μM内引物(FIP和BIP)与1.6μM环引物(LF和LB),8U Bst DNA聚合酶大片段,ThermoPol buffer2.5μl, DNA模板2μl, ddH2O补足体积至25μl；扩增温度63℃反应60min,产物于2.5%琼脂糖凝胶电泳分析,得到典型的LAMP梯形条带。LAMP法能检出4株志贺菌,产生特异扩增的梯形条带,其余肠道致病菌均未产生特异扩增的梯形条带,表明选用的志贺菌ipaH基因引物的特异性强。LAMP法对痢疾志贺菌纯菌液检测灵敏度为5.3×101cfu/ml,对人工污染的猪肉样品的痢疾志贺菌检测限为6.8×101cfu/ml。PCR检测的灵敏度为5.3×102cfu/ml,猪肉样品为6.8×102cfu/mL, LAMP的灵敏度均比传统PCR灵敏度高10倍,整个检测过程可在2h内完成。四、结论本研究建立了乳制品中阪崎肠杆菌、肉制品中痢疾志贺菌的LAMP决速检测技术,并在实际样品检测中得到了初步应用。LAMP检测技术针对靶基因的6个区域设计4条(6条)特异引物,特异性强；LAMP检测限为101cfu/mL,是PCR法灵敏度的10倍。LAMP法能直接对奶粉、肉制品、乳制品等食品中的致病菌进行检测,实际样品一般在20～28h内完成检测,与传统的分离培养方法相比,大大缩短了检测时间,节省了人力、物力；使用恒温水浴装置即可完成反应,通过观察反应液浑浊度变化,或加入荧光染料SYBR Green I后观察反应液的颜色变化,直接用肉眼即可判读结果,不需要使用昂贵、精密的仪器设备,实现反应及产物检测一步完成,操作简便,检测成本低,适用于现场检测和大量样品高通量检测,尤其特别适合于病原微生物的现场快速检测、战时野外、小型实验室以及基层卫生单位的推广使用。