黄连中黄连碱及表小檗碱抗幽门螺杆菌作用机制研究

来源 :广州中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:a200638012
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目的:比较黄连中小檗碱、药根碱、表小檗碱、巴马汀和黄连碱抑制幽门螺杆菌(HHelicobacter pylori,H.pylori)及抑制脲酶的作用,并尝试以洋刀豆脲酶(Jack bean urease,JBU)为模式酶,探讨黄连碱及表小檗碱抑制幽门螺杆菌脲酶(Helicobacter pylori urease,HPU)的潜在作用机理,以期为黄连治疗H.pylori感染相关性疾病提供基础的研究资料。方法:1.黄连五种生物碱抑制H.pylori作用研究采用琼脂稀释法,分别以克拉霉素和甲硝唑为阳性药,测定黄连中五种生物碱抑制H.pylor的最小抑菌浓度。2.黄连五种生物碱抑制脲酶作用研究采用靛酚蓝显色法,以乙酰氧肟酸为阳性对照,测定黄连中五种生物碱抑制JBU及HPU的半数抑制浓度(IC50)。3.黄连碱、表小檗碱抑制脲酶机理研究分别以HPU和JBU为研究载体,运用分子对接试验、生物碱-硫醇试剂-脲酶相互作用试验、脲酶Ni2+竞争性抑制剂保护试验及脲酶再活化试验,探讨黄连碱及表小檗碱抑制脲酶的动力学及抑制位点。结果:1.抗H.pylori作用研究黄连中五种生物碱抑制H.pylori的最小抑菌浓度在25-100 μg/mL之间。其中,黄连碱作用效果最佳,其次是小檗碱,表小檗碱,巴马汀和药根碱。2.对脲酶活性抑制作用研究黄连中五种生物碱均能不同程度地抑制HPU及JBU的活性,其抑制HPU的IC50值在2.96-4631.98 μM之间,抑制JBU的IC50值在2.23->10000 μM之间。其中,表小檗碱抑酶作用最强,远远优于标准脲酶抑制剂乙酰羟肟酸,其次是巴马汀、黄连碱、药根碱和小檗碱。3.黄连碱抑制脲酶机理研究研究结果显示,黄连碱抑制HPU及JBU的模式均为混合型;黄连碱可通过与HPU的Ni2+及巯基基团结合,从而影响HPU的活性,而JBU结构中的巯基基团与黄连碱抑制JBU的活性密切相关;此外,黄连碱对两种脲酶的抑制作用具有可逆性,加入二硫苏糖醇可恢复二者的活性。4.表小檗碱抑制脲酶机理研究研究结果显示,表小檗碱抑制HPU及JBU的模式分别为可逆的反竞争性抑制类型及竞争性抑制类型;表小檗碱抑制HPU及JBU的作用可能与其与脲酶氨基酸上的巯基结合有关,而与Ni2+无关。结论:结果显示,黄连中五种生物碱均能有效的抑制H.pylori及脲酶的活性。但是这五种生物碱抗H.pylori与脲酶的作用强弱却存在差异,抗菌作用效果依次为:黄连碱>小檗碱>巴马汀、表小檗碱、药根碱,而抑酶作用效果却是:表小檗碱>巴马汀>.黄连碱>药根碱>小檗碱。各生物碱抑制脲酶机理也有不同,黄连碱为可逆的、作用于脲酶Ni2+及巯基基团的混合型脲酶抑制剂;而表小檗碱则为可逆的、作用于脲酶巯基活性基团的反竞争性HPU抑制剂及竞争性JBU抑制剂。结果提示,黄连碱、表小檗碱能通过靶向脲酶活性位点以抑制脲酶活性,且脲酶为黄连碱及表小檗碱抑制H.pylori的作用靶点之一。
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