论文部分内容阅读
鲨烯合酶(squalene synthase,SS)是植物三萜生物合成通路中的一个关键酶,能催化两分子的法呢基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)缩合生成鲨烯(Squalene,SQ),SS在三萜合成通路中对后续产物有着至关重要的作用,其活性决定了后续产物的合成。近年来人们越来越重视如何提高SS的活性来增加三萜皂苷的含量。本研究采用cDNA末端快速扩增技术3’RACE及5’RACE的方法首次克隆得到雪胆鲨烯合酶SS基因全长cDNA序列,同时对雪胆SS进行了生物信息学和正选择进化分析,为探索正选择位点与雪胆SS活性功能位点的潜在关系的奠定了基础,在氨基酸的进化水平上探讨三萜皂苷生物合成机制,希望能为增加三萜类皂苷产量提供有价值的信息。本论文的主要研究结果如下:1、雪胆SS基因的克隆:本研究主要采用3’RACE及5’RACE基因扩增的方法,分别得到1200bp,630bp左右的序列,拼接得到雪胆SS基因cDNA序列,序列长度为1609 bp,其中ORF序列长度为1254 bp,编码417个氨基酸残基,经预测,雪胆SS蛋白的分子量大小约为47.81kD。2、雪胆SS基因的序列分析:通过NCBI的Blast比对,结果显示雪胆SS基因的DNA序列与葫芦科其他植物如绞股蓝的SS的DNA序列有很高的同源性,高达92%,其氨基酸序列的同源性也高达93%。3、正选择分析:通过贝叶斯方法构建陆生植物SS基因的系统发育树,发现雪胆SS基因与葫芦科植物罗汉果、绞股蓝、截叶栝楼、红花栝楼的SS亲缘关系最近,聚为一支,且其后验概率均为1.00。经GeneDoc比对,雪胆SS的cDNA序列,与其他葫芦科植物的SS基因有很高的同源性。通过PAML4软件,利用位点模型、枝模型、枝位点模型检测并分析了雪胆及59种陆生植物鲨烯合酶的适应性进化。检测结果表明,雪胆SS基因受到正选择进化作用。本研究共检测在位点模型中检测到45个正选择位点,而在枝位点模型中检测到12个,且这些正选择位点大部分正选择位点集中于第2跨膜区及其两侧。同时发现189S、196S、265T、389P、390T、407S、410R、414N这8个正选择位点很可能参与SS的生物学过程,进而影响SS的活性。尤其是位点196S,其与雪胆SS及丝氨酸磷酸化位点重合且在位点模型和枝位点模型均检测到196S,因此我们推测这个位点与SS酶功能的关联性最大。以上这些位点对探讨植物SS的关键功能位点和结构起到了重要的参考作用,后续可通过定点突变实验可进一步验证这些位点的功能。本研究成功克隆得到雪胆SS基因的全长cDNA序列,并对雪胆及陆生植物鲨烯合酶进行了正选择分析,为进一步研究葫芦科植物三萜合成通路中关键酶SS的正选择位点及功能的关联性分析奠定基础。本研究从通路进化的角度,利用分子进化方法研究了SS的适应性进化,后续可通过正选择位点的筛选,进行定点突变分析,找出SS结构与功能的关系,针对性地对功能位点进行激活,使SS酶的表达量有所提高,促进三萜皂苷的合成。本论文希望能为增加三萜类皂苷产量提供有价值的信息。