【摘 要】
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神经元是构成整个神经环路的基础,这与生命的认知,学习,感觉等功能息息相关。神经元的分化对复杂神经环路的形成至关重要,神经元发育的缺失与障碍会导致多种疾病,如癫痫、智障、自闭症、精神分裂症等。探究神经元分化的调控机制对我们更好地了解神经元发育,预防和治疗神经发育相关疾病具有重要意义。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子,由pre-mRNA反向剪接而成。它
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神经元是构成整个神经环路的基础,这与生命的认知,学习,感觉等功能息息相关。神经元的分化对复杂神经环路的形成至关重要,神经元发育的缺失与障碍会导致多种疾病,如癫痫、智障、自闭症、精神分裂症等。探究神经元分化的调控机制对我们更好地了解神经元发育,预防和治疗神经发育相关疾病具有重要意义。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子,由pre-mRNA反向剪接而成。它呈封闭环状结构,不具备5’帽子和3’poly尾,表达稳定不易降解。近年来对circRNA的研究越来越多,研究表明有许多的circRNA富集在脑中,尤其是神经元中,暗示我们circRNA在神经系统中可能起着重要的作用。有研究发现,mmucirc0000250（circRtn4）高表达于神经元,并且随着神经细胞的分化其表达量逐渐上升。本课题在诱导分化的Neuro2A细胞系（N2a）和小鼠大脑皮层原代神经元中进行circRtn4的功能和分子机制研究,期望阐明circRtn4对神经元发育所发挥的作用及其作用机制。本课题中,我们用N2a细胞和小鼠原代皮层神经元验证了,随着神经细胞的分化,circRtn4的表达量确实是逐步上升的。随后,我们采用siRNA对N2a细胞和小鼠原代皮层神经元进行circRtn4的敲减,通过免疫荧光染色实验发现N2a细胞最长神经突起长度,神经突起总长度都有所降低。类似的,原代神经元神经突起分支数,最长神经突起长度,神经突起总长度都显著降低。随后,过表达circRtn4,N2a细胞和小鼠皮层神经元神经突起分支数,最长神经突起长度,神经突起总长度都明显增加。这些结果表明circRtn4具有促进神经突起生长和分支的作用。荧光原位杂交（FISH）实验和核质分离实验表明circRtn4主要富集在细胞质中,这提示我们circRtn4可能通过作为microRNA（miRNA）海绵的机制发挥作用。通过miRDB数据据库预测,我们选择了12个可能与circRtn4结合的miRNA进行验证。双荧光素酶报告实验和RNA反义纯化试验（RAP）证明,circRtn4与miR-24-3p有直接结合。随着N2a细胞和小鼠原代皮层神经元的分化,miR-24-3p的表达量呈现出下降的趋势,这也与circRtn4表达量的上升相对应。为探索miR-24-3p在神经突起生长发育中所起的作用,我们对miR-24-3p分别进行了过表达和敲减,结果证明,在N2a细胞和小鼠原代神经元中,miR-24-3p对神经突起的生长有抑制作用。另外,我们将circRtn4过表达质粒上miR-24-3p的结合位点突变掉,并用其转染N2a细胞和小鼠皮层神经元,我们发现过表达circRtn4对神经突起生长的促进作用被逆转。这些结果说明circRtn4确实可以通过miR-24-3p发挥作用。为了探究circRtn4/miR-24-3p发挥作用的下游靶基因,我们将N2a细胞系敲减circRtn4后进行了转录组测序,筛选出下调的基因并与数据库预测的miR-24-3p的靶基因取交集筛选出6个可能的靶基因。用双荧光素酶报告实验对这些基因进行验证后发现CHD5与miR-24-3p有直接结合。Western Blot实验证实,CHD5的蛋白表达水平受到circRtn4和miR-24-3p的调控。此外,随着N2a和小鼠原代皮层神经元的分化,CHD5的表达量呈现出上升的趋势。随后我们进行过表达circRtn4促进N2a细胞神经突起生长的rescue实验,我们发现在N2a细胞系中敲减CHD5可以逆转过表达circRtn4对神经突起生长的促进作用。综上,我们的实验表明,circRtn4可以促进神经突起生长发育。通过对其具体分子机制的探索,我们发现circRtn4是通过作为miR-24-3p的海绵进一步调控CHD5的表达发挥作用的。
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