[研究背景]胶质瘤(Glioma)是中枢神经系统中最常见的原发性、恶性肿瘤,约占所有原发性中枢神经系统肿瘤的30%,约占中枢神经系统恶性肿瘤的80%。其中恶性度最高的是胶质母细胞瘤(glioblastomamultiforme,GBM),约占胶质瘤的一半以上。目前国内外临床针对胶质瘤患者普遍建议采用“手术+放、化疗”综合治疗方案,但是GBM的中位生存期也仍然只有15个月左右。虽然近年来手术设备更新、技术改进、放化疗技术的不断发展,但是胶质瘤的治疗效果依旧差强人意,仍然没有取得重大突破,同时胶质瘤的明确致病因素仍不清楚,有关胶质瘤发生发展的分子机制研究一直是学术界的热点之一。2013年研究人员对胶质瘤全基因组进行了分析,结合近年来有关胶质瘤研究的相关结果,目前胶质瘤常见的突变基因有 PTEN,TP53,EGFR,PIK3CA,PIK3R1,NF1,RB1,IDH1 和 PDGFRA 等,常见易感通道有p53,Rb,PI3K等。除了研究功能基因,非编码RNA(Non coding RNA)逐渐成为包括肿瘤在内的各类生物领域研究的热点,有研究表明非编码RNA(包括micRNA、lncRNA等)参与了肿瘤(包括胶质瘤)的发生、发展过程,同时非编码RNA通过影响编码基因发挥作用的机制是目前研究重点。长链非编码RNA(Long-non coding RNA,lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA,不具有蛋白编码功能。根据LncRNA相对于蛋白编码基因的位置不同,可以将其分为5种类型:正义(sense),反义(antisense),双向(bidirectional),基因内(intronic),基因间(intergenic);而根据lncRNA的功能,则可将其分为信号分子(Signal molecule)、诱饵分子(Ecoymolecule)、引导分子 Guide molecule)和骨架分子(Scaffoldmolecule)等4类。人类基因组中大约2%的序列能够编码蛋白质,大约7%的序列为非转录区,超过90%的基因组序列转录产生非编码RNA。长期以来,人们一直认为非编码RNA是“无功能的垃圾”或“暗物质”。但是最近国内外大量研究显示非编码RNA在多种肿瘤中异常表达,并且在肿瘤的发生、增殖、侵袭性、转移以及预后等过程中发挥着重要作用。2012年斯坦福大学医学院研究人员在《Genome Biology》发表文章“Transcriptional profiling of long non-coding RNAsand novel transcribed regions across a diversepanel of archived human cancers”。他们进行了首个大型的癌症lncRNA表达谱分析,对64个肿瘤样品(包括胶质瘤)高通量RNA-seq测序,在各种肿瘤类型之间找出差异表达的1065个lncRNA。已发现和胶质瘤相关的lncRNAs主要有HOTAIR、H19、CDKN2B-AS、MEG3、ADAMTS9-AS2、CRNDE、TSLC1-AS1 等。目前胶质瘤相关lncRNA研究大部分处于表达异常和初步作用研究,专门针对胶质瘤的lncRNA的检测仍然较少,特别是差异lncRNA表达谱分析、功能探讨以及机制研究仍然不清楚,另外差异表达的lncRNA和胶质瘤已知的基因、蛋白和通道之间的关系以及lncRNA运用于临床等问题仍需进一步实验明确。为了明确胶质瘤相关lncRNA表达谱、作用和机制,本实验采用高通量测序技术分析胶质瘤组织标本与正常脑组织中lncRNA和mRNA的表达差异,结合胶质瘤相关基因、蛋白和通道等信息,采用生物信息学手段筛选出具有差异表达的lncRNAs,构建共表达网络,确定目标lncRNA-PAR5,进一步qRT-PCR方法验证PAR5在胶质瘤组织及胶质瘤U87和U251细胞株的表达情况,明确PAR5表达和胶质瘤临床特征以及分子标记物等关系,进一步转染实验改变PAR5表达,观察其对胶质瘤细胞表型学影响和作用,并通过RIP和Pulldown等实验探讨了 PAR5潜在的功能机制。[目的]明确胶质瘤组织和正常脑组织相比较是否存在差异表达的lncRNA;对照已有lncRNA数据库,对胶质瘤组织中差异表达的lncRNA的总体差异表达情况进行分析。对胶质瘤差异表达的lncRNAs进行生物信息学分析,结合胶质瘤相关基因、蛋白和信号通道,筛选出对胶质瘤有潜在功能的lncRNAs,再对筛选的lncRNAs进行qPCR实验验证并确定目标lncRNA。明确目标lncRNA-PAR5在胶质瘤组织标本和胶质瘤细胞株U87、U251中的表达情况;明确PAR5和胶质瘤病理级别、病人预后的关系;质粒转染PAR5并明确PAR5对胶质瘤细胞活力、增殖以及迁移能力的影响;探讨PAR5作用于胶质瘤的潜在机制。[方法]收集2012年1月-2014年12月昆明医科大学第一附属医院神经外科就诊住院患者的胶质瘤标本和神经外科需要内减压患者的正常脑组织,存放于液氮保存,Trizol法提取RNA,qPCR检测标本RNA质量,应用高通量测序技术对4例胶质瘤组织和2例正常脑组织进行测序。对测序结果进行初步统计、筛选和分析。对胶质瘤组织中差异表达的基因进行KEGG和GO生物信息分析,对差异表达的lncRNAs和mRNAs进行共表达分析;利用现有lncRNA数据库中相关lncRNA信息并结合中国胶质瘤协作组发布的胶质瘤相关基因、蛋白和通路,对lncRNA进一步筛选;对筛选的10条lncRNA进行qPCR实验验证测序结果的一致性;最终确立lncRNA-PAR5为目标进行后续实验。qPCR实验检测87例胶质瘤组织中PAR5的表达情况,并对PAR5和胶质瘤组织临床特征、胶质瘤患者的预后开展相关性分析;qPCR实验检测PAR5在胶质瘤U87和U251细胞株的表达情况,通过质粒转染分别抑制和过表达PAR5检测其在体外实验中对胶质瘤细胞的细胞活力、侵袭、迁移能力的影响;RIP、pulldown实验探讨PAR5对胶质瘤作用的可能机制。[结果]对用于测序的标本进行了 RNA质检,4例胶质瘤组织和2例正常脑组织的RNA总量、纯度和完整性均达到了测序要求;胶质瘤和正常脑组织mRNA比较:差异表达共计2432条,其中上调450条(FC值2倍以上且P<0.05的391条),下调1982条(FC值2倍以上且P<0.05的1409条);胶质瘤和正常脑组织lncRNA比较:差异表达共计488条,其中上调171条(FC值2倍以上且P<0.05的149条),下调317条(FC值2倍以上且P<0.05的264条);差异表达基因KEGG分析结果中和生物体系统有关的最多,有490条,其次和人类疾病有关的有266条,其中和胶质瘤直接相关的有20条,和细胞过程相关的有160条,和环境信息加工有关的27条;差异表达基因GO分析结果中,有1834条与细胞组分相关,有937条与分子功能相关,有2553条与生物学过程有关;结合KEGG和GO分析结果以及胶质瘤相关基因、蛋白和通道筛选出10条lncRNA;在20例胶质瘤组织和正常脑组织组织样本中,对这10个选出的1ncRNAs进行了定量检测:lncRNA1,2,3,4,5,6在胶质瘤组织中的表达均显著下调(P<0.05),lncRNA7,8,9,10在胶质瘤组织中的表达均显著上调(P<0.05),且变化倍数与测序结果趋势一致;结合实验结果和查阅文献确立目标lncRNA4为lncRNA-PAR5;PAR5在胶质瘤组织和胶质瘤U87和U251细胞系中低表达,和对照组相比P<0.05;PAR5的表达水平和胶质瘤WHO病理分级相关,随着WHO病理级别的升高,PAR5相应出现低表达(p<0.05);利用Kaplan Meier生存分析显示PAR5高表达患者的存活率较PAR5低表达患者显著提高(P<0.05);利用si-PAR5,p-PAR5分别转染胶质瘤U87、U251以及正常HF细胞株,并分别设立si-NC,p-NC对照组,实验结果显示,在si-PAR5试验中,PAR5在胶质瘤U87、U251和正常HF细胞株均稳定表达,对比si-NC对照组,si-PAR5组明显低表达;在过表达PAR5试验中,p-PAR5组和p-NC组比较,PAR5的相对表达量在所有实验胶质瘤U87、U251和正常HF细胞株均明显升高(P<0.05);MTT实验、Transwell实验以及Scratch wound实验,我们发现si-PAR5转染组的胶质瘤U87和U251细胞较si-NC空白对照组细胞的迁移和侵袭能力明显提高(p<O.05);对胶质瘤U87和U251细胞株的RIP和qRT-PCR,pulldown和western blot实验,我们发现PAR5主要作用于EZH2。[结论]胶质瘤组织较正常脑组织中存在一类差异表达的lncRNA,差异表达的lncRNA中下调的lncRNA较上调的lncRNA多;胶质瘤组织中仍存在一类目前数据库中未发现的lncRNA;差异表达基因和胶质瘤相关基因、通道和白蛋白有关联;lncRNA与mRNA共表达网络和胶质瘤有关联;lncRNA-PAR5在胶质瘤组织异常低表达,PAR5在胶质瘤组织和胶质瘤U87和U215细胞株中明显低表达;PAR5的表达和胶质瘤大小、WHO病理级别以及KPS评分等临床特征关系密切;PAR5越低表达的胶质瘤病人预后越差;体外实验中,PAR5过表达可以抑制胶质瘤U87和U251细胞的活性、迁移和侵袭;PAR5作用于EZH2发挥“抑癌基因”的作用;PAR5可能是临床胶质瘤亚分子分级、预后和治疗的潜在靶点。