D-塔格糖是一种新型低热量甜味剂,用于食品和药品领域,有抗高血糖和益生保健等多种功能。D-塔格糖为自然界中存在但较为稀有的天然六碳酮糖,是一种D-半乳糖的同分异构体。L-阿拉伯糖异构酶为胞内酶,能够催化L-阿拉伯糖和L-核酮糖进行可逆反应,存在于磷酸戊糖途径和磷酸乙酮醇酶途径中。有研究发现,嗜热菌来源的L-AIs更倾向于催化D-半乳糖转化为D-塔格糖。这一发现有利于应用L-AI实现D-塔格糖的工业化生产。本论文重点阐述了来自源于厌氧性嗜热菌Thermoanaerobacter mathranii的L-阿拉伯糖异构酶(TaMAI)的基因克隆与表达、酶的固定化、酶工程化改造、酶法制备D-塔格糖以及D-塔格糖的分离纯化等方面的内容。我们对来自于Thermoanaerobacter mathranii的TaMAI酶的基因进行了克隆、表达及蛋白的纯化。该基因编码466个氨基酸,蛋白分子量约为53KDa。对TaMAl酶的性质进行了研究,确立了其制备D-塔格糖的最佳反应条件为：pH8.0,60℃,5mM Mn2+,测定了TaMAI催化D-半乳糖生成D-塔格糖的转化率约为39.5%。为获得大量的TaMAI,利用基因工程菌E.coli BL21(DE3)(pET-15b-TaMAI)发酵诱导蛋白的表达,确立了适宜的诱导条件,即以LB为培养基,IPTG终浓度为0.5mM,37℃诱导表达4h。使用发酵罐分批进行高密度发酵,获得了表达量约为摇瓶发酵2倍的TaMAI,大大提高了外源蛋白的表达水平。采用了不同载体材料和固定化方法对TaMAI进行固定化,筛选出了相对酶活较高和重复使用稳定性较强的两种固定化方法,分别为：海藻酸钠直接包埋法和海藻酸钠-活性炭结合法。分别对两种固定化酶的最适pH、最适温度、及其操作稳定性等酶学性质进行了研究并与游离酶进行了比较。结果表明：两者最适pH均为7.5低于游离酶的最适pH8.0;海藻酸钠直接包埋法固定化酶的最适反应物温度为75℃,海藻酸钠-活性碳结合法固定化酶的最适反应温度为70℃,两者催化反应的最适温度均高于游离酶(60℃)；两种固定化酶的热稳定性和酸碱稳定性均比游离酶强,海藻酸钠直接包埋法制备的固定化酶在过夜保存后酶活相比于后者均较高；两者操作稳定性均较强,半衰期分别约为9d和7d。将固定化酶装柱进行连续反应,并对影响D-塔格糖生成的反应条件进行优化。固定化酶反应的最大转化率为43.9%,与游离酶相比,提高了四个百分点,当转化率为23.3%时,D-塔格糖的产率最大,为10g/L·h。固定化酶连续反应168h,其最大转化率仍保持在30%以上。采用两种方法对D-塔格糖进行分离纯化。第一种为酵母细胞选择代谢法,利用酵母细胞能够选择性的代谢D-半乳糖而得到纯的D-塔格糖,这一方法为国内外首次应用于D-塔格糖的纯化。第二种为Ca2+型树脂分离法,我们分别对影响分离效果的因素进行了研究,确定了本实验中所使用的分离柱的最佳分离条件为：温度70℃、流速3ml/min、上样量3ml。离子色谱分析显示,以上两种方法纯化得到的D-塔格糖的纯度均在95%以上。L-AIs的亚基通常有三个结构域,分别是N-末端结构域,中心结构域和C-末端结构域,而TaMAI的酶活性中心位于其中心结构域和C-末端结构域。为阐明其N-末端结构域的功能,通过PCR技术对TaMAI的N-末端进行了不同程度的截短,发现其N-末端结构域对蛋白的可溶性表达及酶的催化活性至关重要。根据大肠杆菌K12的AI(ECAI)晶体结构解析,以及已发表的其他来源的L-AI的定向进化结果,通过序列比对推测对TaMAI的酶活性和D-半乳糖底物亲和性有重要影响的氨基酸残基,分别为Asn223、His313、Ala375、Ser384、G400、Arg419、C441,并分别对其进行了突变。对这些突变体进行研究发现,其中四种突变酶的酶活性及热稳定性有一定的提高,若进行组合突变有望得到各方面性能进一步提高的突变酶。