短蛸（Octopus ocellatus）在我国南北沿海均有分布,因其营养丰富，肉嫩鲜美，生长迅速，已成为我国北部沿海蛸类中新兴的重要经济品种之一。由于短蛸的养殖成活率低、抗逆性差、苗种供应不稳定等因素，目前主要依靠海捕获得。随着短蛸自然资源的不断减少，提高养殖个体种质质量及成活率，以及改善现有养殖模式，已成为亟待解决的问题。从短蛸免疫系统入手，克隆和鉴定免疫相关的基因、分析其表达调控规律、并探讨其在免疫防御中发挥的作用，对于深入了解短蛸免疫机制、筛选抗病基因和提高短蛸抗病力具有重要意义。基于前期工作构建的短蛸cDNA文库，本研究利用现代分子生物学技术分析获得一个短蛸过氧化物还原酶（Prx-4，命名为OoPrx-4）基因和一个Serpin型蛋白酶抑制剂（Serpin，命名为OoSerpin）基因，探讨其在健康短蛸中的组织分布以及在细菌（藤黄微球菌，Micrococcus luteus或鳗弧菌，Vibrio anguillarum）刺激后血细胞中的表达特征，并进一步研究短蛸丝氨酸蛋白酶抑制剂重组蛋白rOoSerpin的生物学功能。过氧化物还原酶属于抗氧化蛋白超家族，普遍存在于好氧生物中，在抗氧化胁迫方面发挥着重要作用。本研究克隆得到了OoPrx-4基因的cDNA全长，其cDNA全长为934bp，包括一个5’非编码区(UTR)19bp，一个3’ UTR177bp，一个开放阅读框(ORF)738bp，共编码245个氨基酸；OoPrx-4的理论等电点PI为6.65，预测分子量为27.1kDa；氨基酸序列1(M)-19(G)为信号肽，51(I)-201(L)是还原酶结构域。多序列比对发现，OoPrx-4与长牡蛎(EKC37672)和光滑双脐螺(ACI42880)的Prx-4相似度最高，分别为78%和73%。通过荧光定量PCR检测了Prx-4在健康短蛸不同组织中的表达分布，以及鳗弧菌刺激后在血细胞中的表达规律。结果发现，Prx-4在短蛸的各个检测组织中都有表达，其中在肝胰腺的表达量最高，在血细胞中表达量最低，两者相差约70倍。受到鳗弧菌刺激后，Prx-4在血细胞中的表达量分别在6h和48h出现两次明显上调，分别升高为刺激前的5.7和28倍。以上实验结果表明Prx-4作为抗氧化酶可能在减少短蛸因抵御病原微生物侵染所产生的过氧化物方面发挥重要的作用。Serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，在抑制蛋白酶有害水解和多种生理活动中具有重要作用。OoSerpin编码基因的cDNA序列全长为1735bp，包括5’ UTR214bp，3’UTR282bp，ORF1239bp，共编码412个氨基酸；OoSerpin的理论等电点为8.52，预测分子量大小为46.5kDa；氨基酸序列1(M)-25(S)为信号肽，49(A)-410(P)为SERPIN结构域。采用荧光定量PCR检测了OoSerpin在健康短蛸不同组织以及受到鳗弧菌或藤黄微球菌浸浴刺激的血细胞中的表达规律。结果表明，OoSerpin在短蛸各个检测组织器官中都有表达，其中在肝胰腺中表达量最高，其次在系统心中的表达量较高，而在外套膜中的表达量最低，两者相差约760倍。在鳗弧菌刺激后，短蛸血细胞中的OoSerpin表达量在刺激后24h显著升高，在刺激后48h上升至最高，为刺激前的85倍。而在藤黄微球菌刺激组中，OoSerpin的表达量在刺激后6和12h就分别显著上升为刺激前的4和3倍；在24h上升到最高，为刺激前的26倍；在48h又有所下降，为刺激前的14倍。将OoSerpin编码区成熟肽克隆入pEASY-E1表达载体中，后转化到大肠杆菌Transetta（DE3）表达菌中，经1‰IPTG诱导表达4h后，纯化并复性后得到重组蛋白rOoSerpin，分析其对胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的抑制作用及对大肠杆菌生长的抑制作用，结果表明，960μgrOoSerpin分别与50μg胰蛋白酶或25μg糜蛋白酶混合孵育30分钟后，能分别抑制86.5%和55.0%的胰蛋白酶和糜蛋白酶活性。此外，rOoSerpin能够显著抑制大肠杆菌的生长，在实验孵育至7.5h时的抑制百分比为40.6%。实验结果显示，OoSerpin在短蛸受到病原微生物刺激后可以被诱导表达，并可以抑制丝氨酸蛋白酶和细菌生长，表明其参与短蛸的免疫应答过程。综上所述，过氧化物还原酶(OoPrx-4)基因和丝氨酸蛋白酶抑制剂(OoSerpin)基因参与了短蛸的免疫应答过程并发挥重要功能。本研究为进一步深入揭示的短蛸免疫防御机制提供了理论基础。