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目的脓毒症时机体对感染产生了失控的炎症反应,大量炎症因子被释放,多条炎症相关信号通路被激活,最终出现多器官功能障碍,死亡率高,而且在治疗上措施少,效果差,花费高。目前急需找到新的治疗切入点。肠道是人体最大的细菌池,脓毒症时过度的炎症反应累及肠道,肠粘膜屏障受损,大量细菌及内毒素入血,加重炎症反应,推动了后续器官损伤的进程。因此肠道既是脓毒症的损伤器官,也是脓毒症向多器官功能障碍发展的重要中间环节,所以对脓毒症时肠屏障功能的保护至关重要。本实验研究骨髓间充质干细胞外泌体对脓毒症大鼠肠屏障功能影响并探讨其相关机制,目的是为脓毒症时肠屏障功能的保护提供方法及理论基础。方法第一部分骨髓间充质干细胞及外泌体的提取:实验提取大鼠股骨及胫骨的骨髓间充质干细胞,采用骨髓贴壁法分离及培养原代细胞,消化培养传代细胞,于光镜下观察细胞形态,采用流式细胞术检测细胞表面抗原进行鉴定;采用离心法提取骨髓间充质干细胞外泌体,在电镜下观察外泌体形态,采用流式细胞术检测表面标志物进行鉴定,保存外泌体为后续实验做好准备。第二部分脓毒症大鼠模型建立及生存率观察:取18只大鼠随机分为3组,(1)正常对照组(n=6)(2)假手术组(n=6),麻醉后开腹,翻动盲肠后逐层关腹,术后为防止休克皮下注射生理盐水20m L/kg。(3)盲肠结扎穿孔术致脓毒症(CLP)组(n=6),采用CLP制备脓毒症大鼠模型,术后为防止休克皮下注射生理盐水20m L/kg。观察大鼠术后一般情况、腹腔情况及生存率。第三部分骨髓间充质干细胞外泌体对脓毒症大鼠肠屏障功能影响及相关机制探讨:取48只大鼠随机分为4组,具体分组为(1)假手术+生理盐水组(n=12):开腹后翻动盲肠关腹并缝合腹壁,于术后2小时经尾静脉注射100μL生理盐水;(2)盲肠结扎穿孔术致脓毒症+生理盐水(CLP+生理盐水)组(n=12)大鼠行CLP,并于术后2小时经尾静脉注射100μL生理盐水;(3)盲肠结扎穿孔术致脓毒症+外泌体(CLP+外泌体)组(n=12):大鼠行CLP,并于术后2小时经尾静脉注射含30μL间充质干细胞外泌体的稀释液100μL;(4)盲肠结扎穿孔术致脓毒症+去外泌体上清液(CLP+去外泌体上清液)组(n=12):大鼠行CLP,并于术后2小时经尾静脉注射不含外泌体的上清液100μL。在6小时和24小时两个时间点,每时间点取6只大鼠,取血浆及小肠组织,在光镜下观察肠组织病理变化,应用ELISA检测血浆中D-乳酸、二胺氧化酶(DAO)、内毒素水平,检测肠组织中肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、白介素-6(IL-6)及髓过氧化物酶(MPO)水平,反应脓毒症时肠粘膜通透性变化、炎症变化以及骨髓间充质干细胞外泌体对其影响;采用westernblot检测不同组别脓毒症大鼠MAPK信号通路及NF-kB信号通路磷酸化水平,以探索骨髓间充质干细胞外泌体对脓毒症时肠屏障功能影响的机制。结果第一部分骨髓间充质干细胞及外泌体的提取:骨髓间充质干细胞接种后24小时可见部分细胞贴壁,3-4天后细胞由多形转变为梭形为主,1周后出现旋涡式集落,9-10天细胞逐渐融合成片。消化传代24小时,细胞完全贴壁,生长旺盛,形态均一呈现梭形。流式细胞术显示培养的骨髓间充质干细胞均一表达CD44 CD105(>95%),而CD34 CD45(<2%)。离心法分离骨髓间充质干细胞外泌体,并于电镜下观察可见囊泡状结构,大小约为30-60nm,流式细胞术显示其表面标志物CD9、CD63、CD81有表达。第二部分脓毒症大鼠模型建立及生存率观察:采用CLP制造脓毒症大鼠模型,术后约6小时左右大鼠病态逐渐明显,出现精神萎靡、呼吸急促、进食及饮水减少、竖毛蜷缩等表现,观察腹腔情况发现CLP组大鼠在CLP术后6小时腹腔内肠管排列紊乱,盲肠有肿胀扩张,腹腔可见少量积液,随时间延长肠管肿胀扩张明显出现粘连坏死,腹腔积液逐渐增多可见血性积液,术后72小时内,假手术组大鼠未发现死亡,CLP组生存率为50%,且大鼠死亡时间主要集中在术后24-48小时。第三部分骨髓间充质干细胞外泌体对脓毒症大鼠肠屏障功能影响及相关机制探讨:在6小时与24小时两个时间点,光镜下假手术+生理盐水组小肠绒毛排列整齐,小肠粘膜结构基本完整,CLP+生理盐水组及CLP+去外泌体上清液组小肠绒毛稀疏排列紊乱倒伏,部分绒毛顶端及固有膜脱落,毛细血管扩张,炎性细胞浸润,CLP+外泌体组小肠粘膜充血水肿,无绒毛及固有层脱落,进行Chius评分后发现,与假手术+生理盐水组相比,CLP+生理盐水组和CLP+去外泌体上清液组大鼠肠组织Chius评分显著升高(P<0.05),而CLP+外泌体组与CLP+生理盐水组和CLP+去外泌体上清液组相比Chius评分显著降低(P<0.05);在6小时与24小时两个时间点,与假手术+生理盐水组相比,CLP+生理盐水组和CLP+去外泌体上清液组大鼠血浆中D-乳酸、DAO及内毒素水平显著升高(P<0.05),而CLP+外泌体组与CLP+生理盐水组和CLP+去外泌体上清液组相比血浆中D-乳酸、DAO及内毒素水平显著降低(P<0.05);与假手术+生理盐水组相比,CLP+生理盐水组和CLP+去外泌体上清液组大鼠肠组织中TNF-α、IL-6及MPO水平显著升高(P<0.05),而CLP+外泌体组与CLP+生理盐水组和CLP+去外泌体上清液组相比肠组织中TNF-α、IL-6及MPO水平显著降低(P<0.05);与假手术+生理盐水组相比,CLP+生理盐水组和CLP+去外泌体上清液组大鼠肠组织中ERK、P38、JNK及NF-kB磷酸化水平显著升高(P<0.05),而CLP+外泌体组与CLP+生理盐水组和CLP+去外泌体上清液组相比肠组织中ERK、P38、JNK及NF-kB磷酸化水平显著降低(P<0.05)。结论1.采用骨髓贴壁法可以成功分离及培养骨髓间充质干细胞,离心法可成功提取外泌体。2.盲肠结扎穿孔术可以成功制备脓毒症大鼠模型。3.骨髓间充质干细胞外泌体可以抑制脓毒症大鼠肠组织炎症反应,降低肠粘膜通透性保护肠屏障功能。4.骨髓间充质干细胞外泌体可以通过抑制脓毒症大鼠肠组织中MAPK信号通路及NF-kB信号通路的激活起到保护肠屏障功能的作用。