蛋白尿是肾小球疾病早期即出现的最常见的临床表现之一,它不仅是反应肾小球损伤的进展和预后情况的指标,并且是导致肾脏病变进展的主要因素,介导了后续的氧化应激,炎症,纤维化,最终导致终末期肾病。前瞻性的临床研究也证实各种肾病中蛋白尿的水平与慢性肾衰竭进展的速度紧密相关。任何能够使蛋白尿减少的治疗干预都有利于减轻慢性肾脏疾病的进展。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成成分之一,对调节肾小球功能发挥关键性作用。足细胞损伤是引起肾小球滤过障碍,最终导致蛋白尿的主要原因之一,因此,鉴于足细胞在肾小球损伤中的重要作用,保护足细胞是阻止肾小球疾病肾功能恶化的主要策略。阿霉素肾病(ADR-induced nephropathy)是局灶节段性肾小球硬化(FSGS)的一个经典动物模型,是目前公认的能较好的模拟肾小球疾病的模型之一。阿霉素(ADR)是一种含醌的蒽环抗肿瘤抗生素,在临床上作为肿瘤化疗药物而广泛应用,ADR可在肾脏内代谢还原为半醌型自由基,后者与氧反应产生活性氧,诱发肾小球上皮细胞脂质过氧化反应,影响肾小球上皮细胞糖蛋白代谢,破坏肾小球滤过膜的结构和功能,最终导致基底膜滤过屏障的选择性变化,从而引起蛋白尿。有研究表明,阿霉素肾病主要是对肾小球足细胞的损伤,肾小球足细胞是位于肾小球基底膜外侧的一种终末期分化细胞,是维持肾小球滤过屏障结构和功能正常的主要细胞之一。足细胞足突及其裂孔隔膜是避免机体蛋白丢失的最后一道屏障,所以足细胞或裂孔隔膜损伤必然伴随大量蛋白尿。阿霉素的肾毒性作用及大量蛋白尿的刺激,进一步诱发肾小球内固有细胞及其他炎性细胞产生并释放各种细胞因子和炎性介质,刺激肾小球系膜细胞增殖和系膜基质增多,缓慢发展形成肾小球硬化；亦能通过多种途径,引起间质炎性细胞浸润,引起肾小管的损伤,促进间质纤维化,最终引起肾脏纤维化,进展为终末性肾衰竭。硝基化脂肪酸(nitrated fatty acids; NO2-FA)是不饱和脂肪酸硝基化的产物,主要有nitrolinoleic acid (LNO2;硝化亚油酸)和nitro-oleic acid (OA-NO2;硝基油酸),已经证明,硝基亚油酸和硝基油酸存在于正常人的血液、尿液、细胞膜以及组织中,利用气相色谱三重四极质谱(GC-MS/MS)技术,检测健康人血中硝基亚油酸浓度大约0.5μM,硝基油酸大约0.6μM,两者加起来超过1μM,因而是内源性产物,意味着硝基脂肪酸在生理浓度范围内可被激活发挥生物学效应。在炎症和代谢应激的情况下,硝基化脂肪酸在人体内的浓度升高。硝基化脂肪酸的信号转导途径特别是在病理生理情况下似乎比较复杂,体外试验证明生理浓度的硝基化脂肪酸具有激活PPARγ的活性(Ki:～133nM),因而被视为内源性PPARγ激动剂；高浓度的硝基化脂肪；作为NO的储藏形式,硝基化脂肪酸还可以释放一氧化氮,激活血管平滑肌细胞的cGMP的产生,最终导致血管扩张；可以诱导血红素加氧酶HO-1的表达而减轻血管炎症反应,从而发挥抗炎和抗凋亡的作用；作为亲电子试剂,硝基化脂肪酸还能S-甲基化Keap-1的关键硫醇,进而激活Nrf2；并且可以使NF-κB的亚基p65共价变形,从而抑制NF-κB活性。硝基油酸因其在体内天然存在,且无明显毒副作用,具有广泛的生物学活性,故其有广阔的临床开发利用前景。硝基油酸对阿霉素肾病是否具有肾脏保护作用,目前国内外均无研究加以详细阐明。针对硝基油酸对阿霉素肾病是否具有肾脏保护作用的问题,以及通过什么作用途径来发挥肾脏保护作用,我们设计了以下实验。目的1.构建阿霉素肾病小鼠模型；2.观察硝基油酸是否对阿霉素肾病小鼠具有肾脏保护作用；3.硝基油酸对阿霉素肾病小鼠肾脏保护作用机制。方法1.阿霉素肾病小鼠模型构建8周龄雄性BALB/c小鼠适应性喂养7天后,42只小鼠随机分为以下各组：对照组(n=8),ADR组(n=18), ADR+OA-NO2组(n=16)。实验处理如下：对照组、ADR组小鼠埋置内含100%PGE的微量泵,ADR+OA-NO2组小鼠埋置内含100%PGE+OA-NO2(5mg/kg/d)(硝基油酸溶于100%PGE溶液,浓度25mg/ml)的微量泵,预处理48小时。48小时后,ADR组及ADR+OA-NO2组小鼠予以尾静脉注射ADR(10mg/kg)(以0.9%的生理盐水溶解,配制成2mg/ml的ADR溶液),对照组小鼠注射等量生理盐水。ADR注射后第3、5、7天,将小鼠置于代谢笼中,收取24小时尿液,离心,将尿液置于-80℃冰箱冻存。并于ADR注射后第8天处死小鼠,采集血液及心肝肾脏组织。2.一般情况观察及体重测量小鼠尾静脉注射ADR后,每天观察小鼠一般状况,如摄食、活动度、精神状态、皮毛光泽度等情况,并称量体重。3.血尿生化指标检测用相应的ELISA试剂盒检测ADR注射后第3、5、7天24h尿白蛋白定量；各项血液生化指标,如血浆白蛋白,甘油三脂(TG),血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)。所有操作均严格按照ELISA试剂说明书进行。4.组织形态学研究肾组织经固定、石蜡包埋后行石蜡切片,切片经Periodic Acid-Schiff (PAS)染色,观察肾组织损伤及肾小球硬化情况。5.实时定量RT-PCR检测取新鲜肾组织,提取mRNA,实时荧光定量RT-PCR检测肾组织GAP(D)H亚基p47phox、gp91phox、TGF-β、α-SMA、FN、Collagen Ⅲ、TNF-α、IL-1β、 MCP-1、WT1、ZO-1、desmin mRNA的表达水平。6.Western Blot检测取新鲜肾组织,提取蛋白质,Western Blot检测肾组织gp91phox、α-SMA、 FN、WT1蛋白的表达水平。7.硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)检测ELISA试剂盒检测血浆、尿液及肾脏组织硫代巴比妥酸反应产物(TBARS),所有操作均严格按照ELISA试剂说明书进行。8.统计学处理实验数据采用均数±标准差(x±S)表示,使用统计软件SPSS11.0处理,组间均数的比较采用方差齐性检验与单因素方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果：1小鼠的一般情况与对照组相比,ADR组小鼠状态略差,进食、活动等减少,精神略萎靡,硝基油酸(OA-NO2)预处理组小鼠状态无明显变化。各组小鼠自ADR注射后体重均有先下降后增高的趋势,OA-NO2预处理对体重变化无明显影响。2.硝基油酸预处理48h对尿白蛋白、血浆白蛋白、以及甘油三酯的影响尾静脉注射ADR3天后ADR组小鼠24h尿白蛋白明显增加(P<0.01),到第5天达到最大值(P<0.01)；OA-N02预处理48h能明显改善第3天(P<0.01)、第5天(P<0.01)尿白蛋白水平；尾静脉注射ADR8天后ADR组小鼠血浆白蛋白浓度显著下降(P<0.01),OA-N02的预处理能明显改善血浆白蛋白水平(P<0.01)；尾静脉注射ADR8天后ADR组小鼠血浆甘油三酯浓度显著增加(P<0.01), OA-NO2预处理能明显改善血浆甘油三脂水平(P<0.01)。3.硝基油酸预处理48h对肾脏功能的保护作用与正常对照组小鼠相比较,ADR组小鼠血浆Cr值约升高5倍(P<0.01),BUN约升高2倍(<0.01)。OA-N02预处理可显著降低Cr(P<0.01),BUN降至正常水平(P<0.01)。4.硝基油酸预处理48h对肾小球损伤的保护作用与正常对照组小鼠相比较,ADR组小鼠的肾组织形态异常,表现为肾小球系膜基质及细胞数量明显增多,Bowman’s腔隙变窄,肾小管扩张明显,伴上皮细胞空泡变性,部分小管出现上皮细胞崩溃脱落,小管结构不完整,同时可见大量蛋白管型。与之形成鲜明对比的是,OA-NO2预处理可显著改善这种病理改变。组织病理半定量分析,对照组各项指数无明显改变,ADR组肾小球硬化指数(GSI)和小管间质纤维化指数(TIFI)明显增高(P<0.01),OA-N02预处理后能明显降低GSI和TIFI(P<0.05)。5.硝基油酸预处理48h对肾小球足细胞的保护作用与正常对照组小鼠相比较,ADR组小鼠肾组织足细胞标记物WT1mRNA及蛋白表达明显下降(P<0.01),OA-N02预处理可显著改善其低表达(P<0.05)。ADR组小鼠肾组织ZO-1mRNA表达亦有下降趋势(P=0.09),OA-NO2预处理可显著改善其低表达(P<0.01)。ADR组小鼠肾组织desmin mRNA表达明显升高(P<0.01),OA-N02预处理可显著降低其高表达(P<0.05)。6.硝基油酸预处理48h对肾脏纤维化的影响与对照组比较,ADR分别诱导α-SMA、FN mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.01),而OA-NO2可显著性降低其高表达(P<0.05)。ADR亦明显升高TGF-β及Collagen Ⅲ mRNA表达水平(P<0.01),而OA-NO2预处理可显著性降低其高表达(P<0.05)。7.硝基油酸预处理48h对肾脏氧化应激的影响与对照组比较,ADR组小鼠血浆TBARS浓度升高达5倍,24h尿液TBARS水平升高2倍,而OA-NO2预处理能明显降低血浆TBARS浓度以及24h尿液TBARS水平(P<0.05)。ADR组肾脏gp91phox mRNA及蛋白分别升高2倍及2.5倍,预处理OA-N02明显降低其高表达(P<0.05)。ADR亦可诱导p47phox mRNA升高2倍,预处理OA-N02明显降低其高表达(P<0.01)。8.硝基油酸预处理48h对肾脏炎症因子及粘附因子的影响ADR可诱导肾脏TNF-α、IL-1β及MCP-1mRNA表达明显升高(P<0.01),预处理OA-NO2可显著降低其高表达(P<0.05)。结论：1.首次通过动物实验证实硝基油酸在阿霉素肾病中具有明显的肾脏保护作用。预处理硝基油酸48h,可降低尿蛋白,改善低蛋白血症,高脂血症,减轻肾损伤,保护肾功能,保护肾小球足细胞的作用。2.初步探讨硝基油酸的肾脏保护作用机制。硝基油酸通过参与调节氧化应激、纤维化以及炎症反应信号通路,抑制氧化应激,纤维化以及炎症介质、炎症因子的产生及释放,发挥抗氧化、抗纤维化以及抗炎作用,从而起到肾脏保护作用。3.为硝基油酸作为临床抗炎、抗氧化、抗纤维化以及治疗肾小球疾病、降低尿蛋白的新型药物开发提供了更有力的证据及实验思路。