近年来,针对包括围术期脑损伤在内的脑缺血损伤的研究已成为神经科学领域的研究重点,如何防治脑缺血损伤也成为科学界急需解决的重大医学问题,因此充分调动神经系统的内源性保护机制,进一步探索理想有效的神经保护措施显得尤为关键。我们课题组早在前期研究中发现,在缺血损伤前给予吸入性麻醉药例如异氟烷、七氟烷等,可减小脑梗死面积诱导缺血耐受,从而发挥神经保护作用。然而,异氟烷预处理神经保护效应的作用机制尚未明确,蛋白质的合成、翻译及修饰作为细胞生存及功能实现的重要途径,是否介导脑缺血损伤及异氟烷预处理过程呢?泛素-蛋白酶体系统(UPS)与其衍生的SUMO系统,分别介导泛素化和SUMO化这两个重要的蛋白调控途径,与细胞命运密切相关。研究发现异常泛素化蛋白聚集与神经细胞损害密切相关,然而SUMO蛋白并不促使蛋白质降解,而是加强蛋白稳定性。有研究者对冬眠动物的研究中发现,损伤或应激状态下神经元内结合型SUMO蛋白的增加可能对提高细胞对缺血缺氧等损伤的耐受具有重要意义。那么我们进一步思考,作为细胞调节中的两个重要系统UPS和SUMO,二者在脑缺血损伤及预处理神经保护效应中是如何发挥作用并相互调节的?本课题旨在揭示UPS/SUMO系统参与脑缺血损伤及神经保护效应的机制,将有助于提高我们对脑缺血损伤的认识,并为未来寻找基于UPS/SUMO系统的新的药物或干预措施应用于临床神经保护奠定基础。实验一异氟烷预处理对神经细胞氧糖剥夺损伤具有保护作用目的:研究异氟烷预处理对培养的类神经元细胞缺氧损伤的神经保护效应。方法:采用SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系经过视黄酸刺激后,诱导分化成为类神经元细胞,通过检测神经元标志物Neu N和βⅢ-Tublin的表达变化,确定诱导分化成类神经元细胞的时间。进一步观察异氟烷预处理对氧糖剥夺(Oxygen-glucose deprivation,OGD)损伤细胞的神经保护作用。细胞为分4组:Sham组、Iso组(单纯吸烷组)、OGD组(氧糖剥夺组)、Iso PC组(异氟烷预处理组)。Iso组和Iso PC组均给予2%异氟烷单次吸入2 h,OGD组和Iso PC组均进行氧糖剥夺损伤4 h,并且在异氟烷预处理24 h后进行。分别在复氧后24 h后进行MTT比色法、流式细胞仪以及检测caspase-3含量以判断各组细胞活性和细胞凋亡,证实异氟烷预处理对细胞氧糖剥夺损伤的保护作用。结果:加入视黄酸刺激诱导分化7天后的SH-SY5Y神经标志物表达最强,因此在后续实验中选择诱导分化7天的细胞进行检测。缺氧损伤后24 h,细胞凋亡率增加,细胞活性降低,给予单次异氟烷预处理可以增加细胞存活率,减少细胞凋亡。结论:视黄酸刺激可以诱导SH-SY5Y细胞分化成类神经元细胞;单次异氟烷预处理对氧糖剥夺损伤模型的细胞具有神经保护作用。实验二异氟烷预处理对大鼠局灶性脑缺血损伤具有脑保护作用目的:研究异氟烷预处理诱导的大鼠缺血耐受效应。方法:SD大鼠随机分为4组:Sham组(空白对照组)、Iso组(单纯吸烷组)、MCAO组(缺血损伤组)、Iso PC组(异氟烷预处理组)。Iso组和Iso PC组连续5天每天吸入2%异氟烷1 h;MCAO组和Iso PC组进行大脑中动脉阻闭模型(Middle cerebral artery occlusion,MC AO),缺血时间为120 min,缺血模型在异氟烷预处理后24 h进行。缺血再灌注后不同时间点24 h、48 h、72 h、7 d分别进行神经功能学评分(Neurological behavioral score,NBS)以及TTC染色评估脑梗死容积百分比,证实异氟烷预处理对大鼠局灶性脑缺血损伤模型的神经保护作用。结果:在局灶性脑缺血损伤后24 h,大鼠神经功能学评分相比Sham组降低,脑梗死容积明显,随着再灌注时间延长,脑梗死容积逐渐缩小。给予异氟烷预处理可以明显减小脑梗死容积百分比,提高神经功能学评分,减轻大脑中动脉阻塞模型对脑组织的损伤作用。说明异氟烷预处理对于局灶性脑缺血损伤具有脑保护作用。结论:异氟烷预处理对局灶性脑缺血损伤具有短期神经保护效应。实验三异氟烷预处理通过抑制结合型泛素蛋白聚集诱导脑缺血耐受目的:研究泛素系统在脑缺血损伤和异氟烷预处理中的作用。方法:SD大鼠随机分为5组:Sham组(空白对照组)、MCAO 24 h组(缺血损伤后24 h组)、Iso PC 24 h组(预处理保护24 h组)、MCAO 72 h组(缺血损伤后72 h组)、Iso PC 72 h组(预处理保护72 h组)(每组8只)。除了Sham组以外,其它4组均进行MCAO模型,Iso PC 24 h组和Iso PC 72 h组在MCAO模型前24 h给予连续5天2%异氟烷吸入每天1 h。分别在损伤后24 h和72 h进行取材,分别进行Ubiquitin蛋白Western blot和免荧组化染色,了解泛素蛋白系统在脑缺血损伤及异氟烷预处理后不同时相的变化趋势和分布特点。结果:免疫荧光结果显示局灶性脑缺血损伤后24 h即可观察到异常泛素蛋白的聚集,并且在损伤后72 h均维持在高表达,异氟烷预处理可以明显减少泛素蛋白的表达。Western blot结果也显示,损伤后结合型泛素蛋白表达增加,游离型泛素蛋白减少,异氟烷预处理可以完全逆转泛素蛋白的表达,从而发挥神经保护作用。结论:异氟烷预处理抑制缺血后结合型泛素蛋白的聚集,发挥脑保护作用。实验四异氟烷预处理通过改变SUMO系统蛋白表达诱导神经保护作用目的:研究异氟烷预处理对SUMO系统蛋白和Ubc9蛋白表达的影响。方法:实验分为离体实验和在体实验。离体实验中,采用诱导分化成功的SH-SY5Y细胞系进行实验,细胞共分为4组:Sham组、Iso组、O GD组、Iso PC组,在复氧后24h进行免疫荧光染色和Western blot检测,观察SUMO-1、SUMO-2/3、Ubc9蛋白的细胞分布特点及表达变化。在体实验中,将第四军医大学实验动物中心的SD大鼠随机分为6组:Sham组、Iso组、MCAO 4 h组、Iso PC 4h组、MCAO 24 h组、Iso PC 24 h组(每组8只)。在再灌注后4 h和24 h分别进行免疫荧光染色和Western blot检测,观察SUMO系统和Ubc9蛋白在脑组织中的表达及蛋白含量变化。明确SUMO系统以及SUMO连接酶Ubc9参与缺血损伤和神经保护作用的机制。结果:离体实验中,在OGD损伤后24 h,结合型SUMO-1表达减少,游离型SUMO-1表达增加,异氟烷预处理可以上调结合型SUMO-1蛋白表达,抑制游离型SUMO-1水平;然而结合型SUMO-2/3在损伤后表达升高,异氟烷预处理可减少SUMO-2/3表达;复氧4 h和24 h后Ubc9的表达均明显减少,且在4 h达到最低,异氟烷预处理可以增加Ubc9的表达,但是在损伤后24 h影响不明显,无统计学意义。在体实验中SUMO-1的表达减少,在24 h基本恢复到正常水平,异氟烷预处理可以逆转缺血对SUMO-1表达的抑制作用;缺血损伤可以增加结合型SUMO-2/3蛋白的聚集,但是异氟烷预处理对结合型SUMO-2/3的表达没有影响;Ubc9在缺血后表达下调,异氟烷预处理可以增加Ubc9的表达。说明SUMO系统参与缺血损伤及异氟烷预处理作用。结论:异氟烷预处理通过调节SUMO蛋白和Ubc9蛋白的表达调控神经保护作用。实验五调控Ubc9对异氟烷预处理的神经保护作用影响研究目的:研究调控SUMO化的E2酶Ubc9蛋白异氟烷预处理诱导神经保护效应的影响。方法:实验分为离体实验和在体实验两部分。离体实验中,采用慢病毒转染的方法构建稳定过表达Ubc9的SH-SY5Y细胞系,用si RNA下调细胞Ubc9的表达,之后再进行异氟烷预处理和OGD模型。实验分为8组:Sham组、Iso组、OGD组、Iso PC组、Lenti+OGD组(过表达慢病毒+氧糖剥夺损伤组)、Lenti+Iso PC组(过表达慢病毒组+异氟烷预处理组)、si RNA+OGD组(小干扰RNA+氧糖剥夺损伤组)、si RNA+Iso PC组(小干扰RNA+异氟烷预处理组)。复氧后24 h通过MTT比色法和检测caspase-3的含量观察类神经元在氧糖剥夺损伤后和异氟烷预处理后细胞活性和细胞凋亡程度。在体实验中,给予大鼠侧脑室微注射si RNA,下调大鼠脑组织中Ubc9的表达,随后进行异氟烷预处理和大脑中动脉阻闭模型。实验分为6组:Sham组、Iso组、MCAO组、Iso PC组、si RNA+MCAO组、si RNA+Iso PC组(每组8只)。在再灌注损伤后24 h评估神经功能学评分和观察脑梗死容积百分比,证实SUMO连接酶Ubc9在异氟烷预处理诱导缺血耐受中的作用机制。结果:慢病毒过表达载体可以增加细胞Ubc9和SUMO-1的表达,si RNA可以抑制Ubc9和SUMO-1的蛋白水平,但是二者对SUMO-2/3的表达均没有影响。上调Ubc9的表达可以模拟神经保护作用;下调Ubc9蛋白可以增加细胞对氧糖剥夺损伤的敏感性,并且逆转异氟烷预处理的神经保护作用。给予大鼠侧脑室微注射si RNA-Ubc9可以下调大鼠脑组织Ubc9的表达,使大鼠脑梗死容积增加,神经功能学评分降低,说明Ubc9表达的抑制可以减弱异氟烷预处理的脑保护作用。结论:上调Ubc9可以模拟神经保护作用,下调Ubc9可逆转异氟烷预处理的神经保护效应。