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研究背景致心律失常性右室心肌病(Arrhythmogenic Right Ventricular Cardiomyopathy, ARVC)是一种以心肌细胞逐渐被纤维脂肪细胞取代为特征,以右心室形态与功能异常为主,伴有心脏电生理改变的心肌疾病。临床主要表现为室性心律失常或猝死。近50%的ARVC患者携带桥粒蛋白基因PKP2(plakophilin2)、DSG2(desmoglein2)、 DSC2 (desmocollin2)、DSP (desmoplakin)、JUP (PG, plakoglobulin)突变,因此该病也被称为桥粒蛋白病。另外,非桥粒蛋白DES (desmin)、RYR2 (ryanodine receptor 2)、TMEM43 (transmembrane protein 43)、TGFβ3 (transforming growth factor-β)等基因的突变也被认为与ARVC发生有关。由于该病的遗传异质性和表型多样性,修饰基因和环境因素也在疾病表达过程中有着极其重要的作用。鉴于已知的致病基因突变并不能解释所有ARVC的发生,因而我们推测还有新的ARVC致病基因及其他的致病机制未被发现。我们拟利用全外显子组测序技术结合目标区域捕获测序技术,寻找ARVC新的候选基因,并运用分子生物学等实验技术探索可能的分子发病机制,为寻找ARVC针对性的诊疗方案提供理论基础。研究目的1)筛查ARVC的分子遗传背景,寻找ARVC新的候选基因。2)研究突变基因的功能,探讨其可能导致ARVC的致病机制,为疾病早期诊断及治疗提供依据。研究方法及结果1) ARVC患者的临床特点及病理特征我们入选的ARVC患者共25名,他们均为2006-2013年于我院心脏移植库中诊断为ARVC,并进行心脏移植的患者。其中男性18人,女性7人,平均年龄41.4±13.8岁。另外,有家族史的患者2人,散发病例23人。这些患者的临床症状包括心悸、胸闷、呼吸困难等。对他们移植术后的心肌组织病理检查发现,病变心肌组织大部分被脂肪组织替代,同时伴有纤维化,但心肌细胞未见凋亡,这些病理表现尤以右室最为突出,另有3例患者表现为左室心肌受累。2)利用高通量测序技术筛查疾病候选基因选取六名典型患者进行全外显子组测序筛查基因背景,根据测序结果确定候选基因集,然后扩大样本至25例患者进行目标区域捕获测序,根据生物信息学分析及功能预测分析,得到致病基因突变结果和可能的候选致病基因,并进行Sanger测序验证。25例ARVC患者中,5例患者携带桥粒基因突变(DSG2,PKP2,DSP),1例患者携带细胞骨架蛋白基因突变(DES)。另外,10人携带与Hippo信号通路相关的基因FAT4突变、4人携带转录因子TBX家族的基因突变及4人携带核骨架蛋白基因SYNE1突变,我们推测这些基因突变可能与ARVC发生有关。3)突变基因的功能学研究及新的分子致病机制的探索用免疫组织化学技术及Western blot技术检测致病基因编码的相关蛋白的定位及表达变化。结果显示,携带DSG2 p.F531C的患者心肌组织中,DSG2的定位与蛋白表达均异常；其中一名患者心肌组织中出现JUP及Cx43定位异常。细胞学水平的验证也表明,该变异影响了蛋白DSG2的定位及表达。携带DSG2 p.L797Q和DSP p.K1937M的患者心肌组织中,DSG2和DSP的定位及表达均无异常,其他闰盘蛋白的定位也没有异常改变。而携带PKP2 (p.S249T和E808fsX30)的病变心肌组织中,PKP2的蛋白表达量显著降低,蛋白JUP、Cx43及N-Cadhesion在闰盘的阳性表达也有所下降。携带DES p.S12F的患者心肌组织中,desmin、JUP和Cx43的定位均异常。为进一步研究疾病发病机制,我们用Western blot检测病变心肌组织中RhoA酶活性及蛋白表达水平,结果显示,除了携带PKP2基因突变的心肌组织外,其他ARVC病变心肌组织中RhoA活性及蛋白表达水平均升高,同时,缝隙连接蛋白Cx43表达水平也升高。细胞学实验结果显示,在HL-1心肌细胞中,Cx43表达水平随着RhoA酶活性升高而变化。结论ARVC是一种原发性遗传性心肌病,疾病的发生发展与其遗传背景密切相关。与既往研究一致,ARVC病变心肌组织呈现纤维化、脂肪化的病理改变,桥粒蛋白基因(DSG2、PKP2、DSP、DES)为该病的主要致病基因。此外,我们发现,小G蛋白RhoA可能通过影响Cx43的表达参与了ARVC的疾病发生过程。在我们的研究中,虽然桥粒蛋白基因是该病主要的致病基因,但对ARVC患者的外显子组测序数据分析显示,还存在其它潜在致病基因,如FAT4、转录因子TBX家族及编码核骨架蛋白的基因SYNE1的突变均可能与ARVC的疾病发生有关系。