第一部分微管亲和调节激酶2在骨肉瘤中的表达及其临床意义研究背景:骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的骨原发恶性肿瘤,尽管年发病率只有3/100万,但严重危害青少年患者的身体健康。由于骨肉瘤具有明显异质性、基因组不稳定性和早期转移以及化疗效果不敏感的特点,骨肉瘤已成为青少年和青年人癌症相关死亡的主要原因。随着化疗技术和外科技术的进步,骨肉瘤的治疗方案由20世纪70年代以前的截肢治疗转变为日益规范的新辅助化疗-手术-辅助化疗的标准方案。未发生转移的骨肉瘤患者5年生存率由原先的不足20%提高到70%左右。尽管如此,近三十年来骨肉瘤患者的生存率未发生显著进步,而且发生转移的骨肉瘤患者5年生存率不足25%。近年来,各种恶性肿瘤的靶向治疗研究如火如荼的进行,很多肿瘤也取得了里程碑式的进展。NCCN指南中推荐索拉非尼（VEGFR抑制剂）作为骨肉瘤患者的二线治疗。因此,有必要进一步探索骨肉瘤新的分子机制,开发新的有效治疗靶点,改善骨肉瘤的预后。微管亲和调控蛋白 2（microtubule affinity-regulating kinase 2,MARK2）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是微管相关蛋白磷酸化的关键成分,并在细胞周期调控蛋白、Ⅱ型组蛋白等细胞因子的磷酸化中起重要作用。研究通过动物基因敲除实验发现,MARK2在神经分化、神经退行性变、细胞极化、细胞内转运及细胞迁移等作用中起重要作用。然而近年来研究发现,MARK2与肿瘤恶性生物学行为及耐药性存在着密切联系。在非小细胞肺癌、宫颈癌等恶性肿瘤中,MARK2高表达且与临床预后不良相关。但MARK2在骨肉瘤中的表达及其相关研究缺乏,因此我们首先进行尝试性探索微管亲和调节激酶2在骨肉瘤中的表达及其临床意义。研究目的本研究旨在探讨MARK2在骨肉瘤中的表达情况及与临床病理特征和预后之间的关系,为进一步研究MARK2在骨肉瘤中发生发展的作用及机制提供坚实基础。研究方法1.我们首先分析了公开数据库骨肿瘤患者中MARK2的表达和临床预后的关系。2.免疫组织化学检测骨肉瘤组织和骨母细胞瘤组织中MARK2蛋白表达情况,并分析骨肉瘤组织中MARK2表达与临床病理特征及预后之间的关系。研究结果1.GEO数据库（GSE12865）的分析发现与正常成骨细胞组织相比,骨肉瘤组织中的MARK2表达升高。TARGET数据的分析表明,MARK2高表达的骨肉瘤患者总生存率和无病生存率低,预后较差。2.免疫组织化学实验结果显示MARK2在骨肉瘤组织中的表达明显高于在骨母细胞瘤组织中的表达。而且MARK2的高表达与肿瘤大小（P=0.0322）,远处转移（P=0.0044）和对化疗的反应相关（P<0.0001）。Kaplan-Meier生存分析表明,MARK2表达较高的患者总体生存期较短。结论MARK2在骨肉瘤组织中高表达,并与肿瘤大小、远处转移和对化疗的反应及患者预后不良相关。第二部分MARK2在骨肉瘤干细胞顺铂耐药性中的作用及机制研究研究背景新辅助化疗、手术、辅助化疗的标准治疗方案使骨肉瘤患者的生存率得到明显的改善。骨肉瘤的标准化疗药物包括顺铂、多柔比星、异环磷酰胺和甲氨喋呤等。尽管最近在诊断和治疗方法上取得了进展,但进年来骨肉瘤患者的存活率仍然停滞不前,事实上仍有约35%的骨肉瘤患者会对上述4种化疗药物产生耐药,尤其是顺铂耐药,化疗耐药常常导致治疗失败,并导致骨肉瘤复发,转移或不可切除,这限制了当前骨肉瘤的治疗效果。因此,有必要进一步探索骨肉瘤的耐药机制,开发新的有效治疗靶点,以逆转骨肉瘤的化疗耐药,改善骨肉瘤的预后。肿瘤干细胞（CSC）是具有自我更新、分化潜能、高致瘤性、高度耐药等特征的一类恶性肿瘤细胞群,虽然在肿瘤中的数量所占比例极少,但对常规放化疗不敏感,被认为是肿瘤发生发展、化疗耐药、转移的根源,对肿瘤的治疗及预后有着重要的意义。因此,肿瘤干细胞理论是化疗耐药的重要原因,分离肿瘤干细胞、进行相关研究,找出药物靶点和相关的信号传导通路,为新的药物及治疗方法的开发提供理论支持。CD133抗原被认为是正常组织和癌组织的干细胞标记。研究鉴定出骨肉瘤细胞系中的CD133+细胞具有肿瘤干细胞的许多特征。肿瘤细胞DNA损伤修复能力也是化疗耐药的重要机制。多项研究发现,在胶质瘤、宫颈癌、非小细胞肺癌以及B细胞慢性淋巴细胞性白血病中,DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）及DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位（DNA-PKcs）的的活性和表达增高。本课题组前期研究发现,CD133+骨肉瘤细胞具有肿瘤干细胞的特性,该群细胞高表达MDR1、DNA-PK基因,在化疗耐药、肿瘤形成以及肿瘤恶性生物学行为中较为突出。DNA-PKcs高表达与骨肉瘤不良预后相关,复发转移的患者中DNA-PKcs 阳性率显著高于无瘤生存患者,DNA-PKcs可作为影响无瘤生存率的预后因素之一。但是,该机制的上游靶点尚不清楚。微管亲和力调节激酶2（MARK2）参与许多细胞功能的调节。近年来研究发现,MARK2与肿瘤的化疗耐药存在着密切联系。MARK2在顺铂耐药的宫颈癌细胞系中过表达。研究发现,在非小细胞肺癌中MARK2高表达并与顺铂抵抗具有密切关系,MARK2的过表达与DNA的低甲基化和复制密切相关。细胞系和原代细胞实验均显示了 MARK2在细胞周期激活和DNA损伤修复中的重要作用。下调MARK2表达后,肺癌细胞内DNA损伤增多、细胞周期发生S期阻滞、NF-κB的活性增高。对此该研究认为MARK2可以通过调节细胞周期增加细胞的DNA损伤修复。PI3K/Akt/mTOR通路的失调与包含骨肉瘤在内的多种肿瘤的化学耐药性有关。第一部分发现,MARK2在骨肉瘤的高表达与对化疗的反应相关,然而,MARK2能否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节DNA-PKcs的表达从而促进骨肉瘤干细胞对顺铂的耐药,仍需进一步研究明确。研究目的本研究旨在探讨MARK2在CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞中对顺铂耐药的作用及其潜在机制。研究方法1.通过MACS（免疫磁珠分选法）获得CD133-和CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞,分别用CCK8细胞活性实验检测其对顺铂的耐药性,并用qRT-PCR和蛋白质印记实验检测CD133-和CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞MARK2的表达。2.siRNA 下调 CD133+MG-63 和 MNNG/HOS 细胞中 MARK2 的表达后,检测顺铂耐药性的变化。3.分别用蛋白质印记实验和细胞免疫荧光实验检测顺铂作用之后CD133-和CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞中DNA损伤修复相关蛋白的表达情况。siRNA下调CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞中MARK2的表达后,检测DNA损伤修复的变化。4.应用蛋白质印迹法对比检测CD133-和CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞中PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白和DNA-PKcs的表达,并在CD133+细胞中加Akt抑制剂后,检测DNA-PKcs的表达水平和顺铂耐药性。下调CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞中MARK2的表达后,检测PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白DNA-PKcs的表达的变化。研究结果1.与 CD133-MG-63 和 MNNG/HOS 细胞相比,CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞显示出较高的顺铂耐药性和MARK2表达水平。2.下调MARK2降低了 CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞的顺铂耐药性,说明MARK2在CD133+MG-63和MNNG/HOS中促进顺铂耐药。3.与 CD133-MG-63 和 MNNG/HOS 细胞相比,CD133+MG-63 和 MNNG/HOS细胞顺铂作用后DNA双链断裂较少,DNA损伤修复蛋白增加。siRNA下调CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞中MARK2的表达后,DNA双链断裂增加,DNA损伤修复蛋白减少。结果说明MARK2可促进CD133+MG-63和MNNG/HOS的DNA损伤修复。4.与 CD133-MG-63 和 MNNG/HOS 细胞相比,CD133+MG-63 和 MNNG/HOS细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路中的关键蛋白、DNA-PKcs的表达水平升高。抑制P13K/Akt/mTOR信号通路的活性后,CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞中DNA-PKcs的表达水平和顺铂耐药性下降。下调MARK2后,CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路中的关键蛋白、DNA-PKcs的表达水平均降低。以上结果说明,MARK2可通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节DNA-PKcs的表达,从而增强CD133+MG-63和MNNG/HOS的顺铂耐药。研究结论1.MARK2在CD 133+MG-63和MNNG/HOS细胞中高表达且与顺铂耐药性有关。2.MARK2通过PI3K/Akt/mTOR信号调节DNA-PKcs的表达从而促进了CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞顺铂耐药,这提供了新的逆转骨肉瘤化疗耐药的策略和治疗靶点。第三部分MARK2在骨肉瘤细胞发生发展的作用及机制研究背景骨肉瘤具有恶性程度高,进展迅速,早期易发生转移的特点,转移90%发生在肺。骨肉瘤患者的主要死因就是肿瘤的肺转移。大约10-20%骨肉瘤患者在初诊时发生远处转移,并且约有50%以上的患者会在病程的不同时期发生转移。尽管标准治疗方案下骨肉瘤的生存率有了明显的提高,但发生转移的骨肉瘤患者5年生存率25%左右。所以远处转移是影响骨肉瘤患者预后的重要因素。对于复发、转移的难治性病例,索拉菲尼靶向药是NCCN推荐的二线药物。分子靶向药物是骨肉瘤的新兴治疗手段,对改善骨肉瘤的预后将会有重要的作用,因此有必要进一步研究骨肉瘤发生发展的机制,寻找新的改善骨肉瘤预后的生物标志物和治疗靶点。微管亲和调节激酶（MARKs）是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可磷酸化微管相关蛋白,例如Tau,并调节细胞骨架动力学和细胞周期进程。人体内有四种MARK形式（MARK1-4）,目前,越来越多的证据表明,MARKs具有多种功能,包括在细胞极性,神经元细胞分化、神经退行性病变、细胞内转运,细胞生长和细胞迁移中的作用。先前的一些研究还表明,MARKs在某些癌症的发生和发展中起着至关重要的作用。作为MARKs家族的成员,据报道,微管亲和调节激酶2（MARK2）通过各种信号途径介导细胞增殖,转移和化学药物耐药,因此在肿瘤的进展和预后中起着举足轻重的作用。第一部分研究发现MARK2在骨肉瘤中高表达,并与肿瘤大小、远处转移和不良预后相关。然而,MARK2在骨肉瘤发病机理和进展中的功能作用和分子机制仍然未知。研究表明,骨肉瘤基因具有高度的不稳定性,PI3K/AKT信号通路在晚期骨肉瘤病例中被激活并参与到骨肉瘤细胞发生发展中,包括细胞增殖,迁移侵袭和化疗耐药的调控。在我们先前的实验中,我们发现MARK2通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路增强骨肉瘤细胞的顺铂耐药性。然而,MARK2是否通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路促进骨肉瘤细胞增殖和转移尚待确定。研究目的研究旨在探讨MARK2在骨肉瘤进展和转移中的作用及潜在机制。实验方法1.用慢病毒建立稳定过表达或敲低MARK2的MG-63和MNNG/HOS细胞。CCK-8法检测细胞增殖情况。流式实验测细胞周期。2.过表达或敲低MARK2后,通过细胞划痕实验、Transwell细胞迁移、侵袭实验检测,观察骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力的变化,并用免疫印迹实验检测转移相关的基质金属蛋白2（MMP2）的表达。3.蛋白质免疫印迹实验检测MARK2过表达和沉默后PI3K/AKT/NF-κB信号通路相关关键蛋白表达水平。4.用PI3K抑制剂LY294002处理MARK2高表达细胞,进行挽救实验。CCK8、细胞流式实验、细胞划痕实验、Transwell细胞迁移、侵袭实验、免疫印迹实验检测PI3K抑制剂是否可以挽救MARK2过表达对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。5.建立裸鼠异种移植骨肉瘤模型,观察过表达和敲低MARK2对皮下肿瘤体积和重量的影响。免疫印迹实验检测裸鼠肿瘤标本中PI3K/AKT/NF-κB信号通路相关关键蛋白和MMP2的表达水平。免疫组织化学实验检测增殖能力相关的指标Ki-67。研究结果1.CCK8实验显示过表达MARK2促进骨肉瘤细胞的增殖水平。细胞流式实验显示MARK2的过表达显著降低了 G1期细胞的百分比,并增加了 S期细胞的百分比。相反,在下调MARK2的骨肉瘤细胞中观察到相反的结果。表明MARK2可能通过加速骨肉瘤细胞的G1-S期转变来促进细胞生长。2.过表达MARK2促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭,同时MMP2的表达水平升高。敲低MARK2抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭,同时MMP2的表达水平降低。表明MARK2可以通过促进MMP2的表达来促进促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。3.过表达MARK2促进骨肉瘤细胞PI3K/AKT/NF-κB信号通路中p-PI3K p85,p-AKT,p-NF-κB/p65 的蛋白水平升高。敲低 MARK2,p-PI3K p85,p-AKT,p-NF-κB/p65蛋白水平降低。结果表明,MARK2可以激活骨肉瘤中的PI3K/AKT/NF-κB 途径。4.挽救实验结果表明,在用LY294002处理的过表达MARK2骨肉瘤细胞中,细胞增殖能力下调,细胞周期G1期比例增加,S期细胞比例减少,细胞的迁移和侵袭能力下降,p-AKT,p-NF-κB/p65和MMP2的表达水平受到抑制,MARK2的表达不受影响,结果提示PI3K抑制剂可以挽救MARK2过表达对骨肉瘤细胞增殖,迁移和侵袭的作用,MARK2至少部分通过激活PI3K/AKT/NF-κB途径调节G1-S转变和MMP2表达来促进骨肉瘤细胞的增殖迁移和侵袭。5.过表达MARK2异种移植骨肉瘤肿瘤的体积和重量均增加。敲低MARK2,异种移植骨肉瘤肿瘤的体积和重量均降低。在过表达MARK2的小鼠肿瘤标本中p-AKT,p-NF-κ/p65,MMP2和Ki-67的表达水平显着增加,而在MARK2沉默的小鼠肿瘤标本中p-AKT,p-NF-κB/p65,MMP2和Ki-67表达水平降低。这些结果表明MARK2可能通过PI3K/AKT/NF-κB途径促进骨肉瘤细胞体内成瘤。结论MARK2通过PI3K/AKT/NF-κB通路调节G1-S相转变和MMP2表达,从而促进了骨肉瘤细胞的增殖,迁移和侵袭。结果提示MARK2可作为骨肉瘤患者的一种新的癌基因和有潜力的治疗靶标。