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牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)或称牛疱疹病毒Ⅰ型(Bovine herpesvirus-1,BHV-1)感染牛引起的一种以高热、呼吸困难、流鼻汁、上呼吸道及气管、黏膜发炎等为主要特征的传染病。BHV-1感染可引起机体免疫抑制,是牛呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)重要的病原之一,给世界范围内养牛业造成了巨大损失。BHV-1的潜伏感染特性使受感染的牛成为重要的传染源,给疾病的控制和消灭带来了极大困难。目前,采用疫苗免疫已成为IBR防控的主要手段。由于BHV-1基因缺失标记疫苗具有血清学免疫标识,可配套使用鉴别诊断方法区分自然感染与疫苗免疫,在一些欧美国家已得到广泛使用。同时,BHV-1还可作为活病毒载体表达其他重要牛传染病的免疫原性基因制备重组多价疫苗。然而,随着基因缺失标记疫苗的深入研究与广泛使用,该疫苗仍存在免疫抑制、潜伏感染、与野型毒株重组导致毒力返强以及血清学标记灵敏度低与鉴别诊断能力不足等问题,有待进一步完善。目前,我国也缺乏有效的商品化BHV-1标记疫苗用于防控。本实验室前期研制了 BHV-1 gG-/tk-基因缺失疫苗,已证实该疫苗的安全有效性,具有一定的应用前景。本研究旨在对BHV-1 gG-/tk-缺失疫苗进行更深入研究,以期研制更加安全有效的缺失疫苗作为IBR防控手段。牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)主要感染牛引起一种以临床和亚临床感染、繁殖障碍、免疫抑制造成的呼吸系统和肠道系统疾病、血小板减少和出血及致死性粘膜病为主要特征的临床症状复杂多样的疾病,也是BRDC重要的病原之一。BVDV感染可形成持续性感染(Persistently infected,PI),使受感染的成为是BVDV传播最重要的传染源,因此,对牛群中的PI牛的检测与剔除是BVDV防控重要的措施。此外,采用疫苗免疫降低BVDV流行率是BVDV防控的重要措施。本研究旨在对我国BVDV进行流行病学与基因型研究,并比较不同的BVDV检测方法,为使用BHV-1 gG-/tk-作为病毒活载体研制有效的BHV-1/BVDV重组二价疫苗提供理论依据。本论文主要研究内容和结果如下:1.BHV-1三基因缺失疫苗的构建与免疫原性研究为了进一步缺失BHV-1 gG-/tk-毒株的免疫抑制基因、提高免疫原性,以及进一步降低其毒力与重组而导致毒力返强的可能性,提高血清学标记鉴别诊断能力,本研究利用磷酸钙法转染MDBK进行同源重组构建了 BHV-1 gG-/tk-/gN-与BHV-1 gG-/tk-/gE-三基因缺失病毒。在兔体上进行了安全性及免疫原性研究,结果显示BHV-1 gG-/tk-/gN-接种组未检测到鼻腔排毒,BHV-1 gG-/tk-/gE-接种组只在接种后第三天检测到有一只兔子排毒。攻wt BHV-1后BHV-1 gG-/tk-/gN-与BHV-1 gG-/tk-/gE-接种组排毒时间分别为6、4天,而BHV-1 gG-/tk-接种组排毒时间仅为两天。进一步在牛体上进行BHV-1 gG-/tk-/gE-的安全性及对wt BHV-1与wt BHV-5的保护性研究,结果显示BHV-1 gG-/tk-/gE-与BHV-1 gG-/tk-相比在牛体上的毒力进一步减弱,对wt BHV-1和wt BHV-5的保护率分别为64.2%、68.6%。以上结果表明,BHV-1 gG-/tk-缺失gN基因毒力进一步减弱,免疫原性降低;BHV-1 gG-/tk-/gE较BHV-1 gG-/tk-更安全,但免疫原性有所下降。2.BHV-1 gG-/tk-基因缺失疫苗不同免疫途径的免疫效果比较为了筛选BHV-1 gG-/tk-疫苗有效且切合临床实际应用的免疫途经,采用滴鼻ON)与肌注(IM)途径对牛体进行该疫苗免疫,并在初次免疫21天后进行加强免疫,结果显示IM途径的疫苗毒株排毒量均显著低于IN途径,但首次免疫后IM途径比IN途径能更早的产生中和抗体和gB抗体与产生更高水平的IL-4(p<0.01)。加强免疫后,IN免疫组诱导产生的sIgA水平显著高于IN免疫一次组与IM加强免疫组(p<0.05),但IM免疫组能诱导更高水平的IFN-γ。攻毒后,IN免疫组的排毒量和排毒时间少于肌注免疫组,且IN加强免疫组的排毒量最少,排毒时间最短,但差异不显著。与未免疫组相比,IM免疫组(包括一次或加强免疫组)的排毒时间与排毒量均显著减少(p<0.001)。以上结果说明,BHV-1 gG-/tk-疫苗采用以上两种途径进行免疫安全性均良好,均能提供有效的保护力,IM可作为该疫苗临床实际应用的有效免疫途径。3.BHV-1 gG-/tk-/gD+与BHV-1 gG-/tk-/gD5+重组病毒的构建与鉴定为了进一步提高BHV-1 gG-/tk-基因缺失疫苗的免疫原性,以及对BHV-5的保护力,本研究基于BHV-1 gG-/tk者因缺失病毒构建了表达双拷贝同源gD(BHV-1 gD)和异源gD(BHV-5 gD,gD5)基因的BHV-1重组病毒,分别为BHV-1 gG-/tk-/gD+与BHV-1 gG-/tk-/gD5+。利用磷酸钙转染法将含有gD胞外区表达盒基因的转移载体与亲本病毒BHV-1 gG-/tk-/EGFP+的基因组DNA共转染MDBK后收获增殖的病毒。通过反向筛选绿色荧光蛋白(GFP),得到重组病毒。PCR检测表明gD与gD5基因胞外区均已插入到重组病毒的tk基因位置;间接免疫荧光试验和Western blot证实重组病毒中的gD或gD5基因胞外区获得了表达;并进行了重组病毒生物学特性研究,结果表明同源gD的插入对BHV-1病毒的复制无影响,异源gD的插入增强了BHV-1在细胞之间的扩散能力,但生长机制与亲本毒株相似。本研究为研制提高BHV-1 gG-/tk-基因缺失疫苗的免疫原性与对BHV-5的保护力的重组病毒及应用该疫苗毒株作为活病毒载体研制重要牛传染病的BHV-1多价疫苗奠定了基础。4.我国BVDV流行病学调查与基因型研究为了探索以BHV-1 gG-/tk-作为病毒活载体的BHV-1/BVDV重组二价疫苗的应用前景,进行了我国BVDV流行病学及基因型研究。2010-2013年采自我国八个不同省市的肉牛、奶牛、牦牛和水牛血清样品共1379份。采用BVDV抗体检测试剂盒、BVDV抗原检测试纸条与套式RT-PCR分别检测BVDV抗体、抗原与核酸阳性率。结果显示我国的BVDV抗体、抗原和核酸总阳性率分别为58.09%(801/1379)、1.39%(14/1010)和22.64%(146/645)。不同地区、牛种类的阳性率高低不一;奶牛、肉牛、牦牛和水牛的抗体阳性率分别为89.49%(298/333)、63.27%(248/392)、45.38%(236/520)和 14.18%(19/134),抗原阳性率分别为 0.00%(0/116)、0.77%(3/392)、0.82%(3/368)和 5.97%(8/134),RT-PCR检测核酸阳性率分别为 32.06%(42/131)、13.00%(26/200)、28.89%(52/180)和 19.40%(26/134)。根据 5’-UTR基因序列进行进化树遗传分析,结果显示存在三种基因亚型:BVDV-lb、BVDV-lm和BVDV-1新亚型(命名为BVDV-lu型),分别占33.06%、49.19%和17.74%。根据Npro基因序列构建的进化树分析证实以上基因型分型。以上结果表明BVDV感染严重。本研究揭示了近几年我国BVDV的流行情况和存在的主要基因型,为制定BVDV有效防控策略和措施提供了科学依据,为研发我国具有自主知识产权的BHV-1/BVDV二价疫苗提供了流行病学依据。