论文部分内容阅读
目的:研究发现,长链非编码RNA(Long non-coding RNA,Lnc RNA)与肿瘤的发生、发展密切相关,本研究中首次发现Lnc RNA RP1-163G9.1在胃腺癌病人中表达异常,我们统计分析其异常表达与临床病理参数的相关性,在细胞和动物水平研究其功能,探讨其可能的机制。方法:1.根据本课题组表达测序结果,分析表达谱数据并查阅文献,选择未曾研究过且表达差异具有统计学意义的Lnc RNA开展后续的研究工作。2.Lnc RNA RP1-163G9.1在组织及细胞中表达水平的检测:利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)方法,GADPH作为内参基因,检测临床收集的胃腺癌样本及癌旁组织及胃癌细胞中的Lnc RNA RP1-163G9.1表达水平,分析表达水平与芯片数据符合性,并分析表达水平与临床病理参数和免疫组化标志物的相关性。3.Lnc RNA RP1-163G9.1胃腺癌组织的原位表达检测:设计Lnc RNA RP1-163G9.1的荧光原位杂交探针,选择30例胃腺癌石蜡包埋组织,利用荧光原位杂交技术(FISH),检测Lnc RNA RP1-163G9.1的细胞表达定位和表达水平。4.细胞功能研究:构建Lnc RNA RP1-163G9.1的真核表达载体,转染入胃癌细胞中,利用G418在胃癌细胞BGC823和SGC7901筛选Lnc RNA RP1-163G9.1和相应空载体的稳定表达细胞株,通过CCK-8增殖实验、Transwell实验、克隆形成实验研究其对肿瘤增殖、侵袭的作用,流式细胞仪检测细胞凋亡和分析细胞周期变化。5.动物实验:选择BALB/c-nu裸小鼠,4-6 W龄,后背外侧皮下接种稳定表达Lnc RNA RP1-163G9.1以及相应空载体胃癌细胞株,8*106/0.1ml/只,每隔7天测定肿瘤的体积,绘制生长曲线。实验结束后处死裸鼠,分离肿瘤组织,测定体积和重量,T-test检验统计分析Lnc RNA RP1-163G9.1组和相应空载体组肿瘤生长情况。提取肿瘤RNA,进行qRT-PCR检测Lnc RNA RP1-163G9.1的表达,同时肿瘤组织HE染色,明确肿瘤的性质。结果:1.表搭谱芯片结果显示所研究Lnc RNA RP1-163G9.1在胃腺癌组织中表达下调,与癌旁组织相比,下调倍数达到140.67。2.qRT-PCR结果:检测112对胃腺癌及癌旁组织,发现Lnc RNA RP1-163G9.1在癌组织的表达呈明显下调(P<0.001),下调表达率为75.89%(85/112),下调倍数为23.94倍。细胞水平检测发现,同正常胃上皮细胞GES-1表达相比,在胃癌细胞BGC823、SGC7901和AGS中,Lnc RNA RP1-163G9.1的表达也表现为下调(P<0.05)。3.与临床病理参数及免疫组化标志物相关性分析:卡方统计分析结果显示Lnc RNA RP1-163G9.1的表达影响胃腺癌病人的肿瘤浸润深度(p=0.001)、淋巴结转移(p=0.001)、肿瘤的大小(p=0.028),并与胃腺癌组化标志物TS(p=0.040)和Ki-67(p=0.017)密切相关,差异具有统计学意义;多因素Logic Regression统计分析显示,高表达Lnc RNARP1-163G9.1能够抑制肿瘤的转移、浸润和肿瘤大小。4.组织原位杂交:30对石蜡包埋的胃腺癌组织切片的荧光原位杂交实验结果显示,Lnc RNA RP1-163G9.1主要在细胞浆内表达,同正常胃组织相比,胃腺癌组织的Lnc RNA RP1-163G9.1表达量低,也进一步验证qRT-PCR的结果。5.细胞功能实验:使用稳定表达RP1-163G9.1和相应空载体的胃癌细胞株BGC823和SGC7901,通过CCK-8增殖实验、Transwell实验,克隆形成实验,结果显示过表达Lnc RNA RP1-163G9.1能够明显抑制细胞增殖和侵袭。流式细胞仪分析稳定表达Lnc RNA RP1-163G9.1的细胞株的细胞周期,发现Lnc RNA RP1-163G9.1的细胞S期比例要低于空载体组,也进一步提示Lnc RNA RP1-163G9.1与细胞增殖密切相关,对细胞凋亡无影响。6.动物实验:根据肿瘤的生长曲线及最终肿瘤体积和肿瘤重量,T-test检验统计表明Lnc RNA RP1-163G9.1组肿瘤的生长速度和最终的肿瘤重量及体积明显小于实验对照组(p<0.05),差异具有统计学意义。结论:1.Lnc RNA RP1-163G9.1在胃腺癌和胃癌细胞中低表达,且低表达可能与胃腺癌的浸润、淋巴结转移和肿瘤大小相关。2.Lnc RNA RP1-163G9.1主要表达在细胞浆,且在胃腺癌组织低表达。3.细胞和动物实验表明,Lnc RNA RP1-163G9.1主要影响胃腺癌的增殖和浸润能力,对凋亡无明显影响。4.Lnc RNA RP1-163G9.1作为一个与胃腺癌增殖相关的分子,可作为一个潜在的预后指标。