目的：建立基于核磁共振和气质联用的代谢组学技术平台,研究有毒中药附子主要毒性成分乌头类生物碱的毒性作用,以及这些生物碱与甘草、干姜代表性成分合用后其毒性的变化规律,探讨其毒性作用机制。方法：利用基于核磁共振和气质联用技术的代谢组学方法对附子主要毒性成分的毒性变化规律进行如下四个方面的研究：1、单次灌胃给予乌头碱、新乌头碱和次乌头碱后对大鼠的急性毒性作用；2、连续十五天灌胃给予低剂量乌头碱、新乌头碱和次乌头碱后对大鼠的亚急性毒性作用；3、多次及单次给予甘草中主要有效成分甘草次酸对新乌头碱毒性的缓解作用；4、单独给予干姜水煎液及联合给予甘草次酸和干姜水煎液预保护对新乌头碱毒性的缓解作用。所有动物实验均采用代谢笼法采集每日12h夜尿,并于实验结束时经股动脉采集血样,并解剖采集所需组织样本。血样、尿样及组织提取样经核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)或飞行时间气相质谱联用仪(Gas Chromatography/Time of flight-mass Spectrometry, GC/TOF-MS)检测后,对数据进行积分处理,并进一步进行统计学处理,寻找特征性代谢产物,揭示毒性变化规律。结果：1、对大鼠单次灌胃给予乌头碱、新乌头碱和次乌头碱后,尿样NMR检测结果显示,给药后6h大鼠尿样的代谢物谱呈现最显著的改变,给药后12h得到缓解,但在给药后24h再次加剧,之后逐步恢复。给药6h后,乌头碱、新乌头碱和次乌头碱给药组大鼠尿样中葡萄糖、乙酸和丙氨酸含量升高,柠檬酸、肌酸、TMAO、2-酮戊二酸和马尿酸等含量降低。给药后7d,血浆NMR测定结果显示,次乌头碱给药后7d大鼠血浆代谢物谱的变化趋势与乌头碱及新乌头碱不同,提示次乌头碱的毒性作用机制可能与乌头碱和新乌头碱存在差异。这种差异主要表现在葡萄糖、乳酸、脂类、OAc、不饱和脂肪酸、低密度脂蛋白／极低密度脂蛋白(LDL／VLDL)、多不饱和脂肪酸和NAc等代谢产物的含量变化规律上。给药后7d大鼠血浆的GC／TOF-MS检测中共鉴定出38个代谢产物,包括多种氨基酸、脂肪酸、糖和有机酸。对其数据进行t-检验和多元统计分析均显示,次乌头碱的毒性作用机制与乌头碱及新乌头碱不同,且毒性较弱。2、连续给予乌头碱、新乌头碱及次乌头碱后,大鼠尿样NMR结果显示给药1d后,各乌头类生物碱给药组大鼠的代谢谱即与对照组产生差异。乌头碱给药组在连续给药第5天后与对照组差别最大,新乌头碱给药组在连续给药后第9天与对照组差别最大,而次乌头碱给药组在连续给药后第13天与对照组差别最大。且从整个给药期间总体差异来看,乌头碱给药组与对照组之间的差异最显著,其次依次为新乌头碱给药组和次乌头碱给药组。这主要表现在乙酸、琥珀酸、甘氨酸、肌酐、肌酸、苯丙氨酸、2-酮戊二酸、柠檬酸、DMA、牛磺酸、TMAO、马尿酸、丙氨酸、DMG、葡萄糖、缬氨酸、3-羟基丁酸等代谢产物的含量变化上。结束给药后,大鼠血浆的NMR结果显示,乌头类生物碱给药组与对照组血浆代谢图谱存在差异,其中乌头碱组最为显著,其次为新乌头碱组和次乌头碱组。主要表现为胆碱、脂类、NAc、OAc、乙酸、3-羟基丁酸、丙酮、乳酸等代谢产物的含量增加,而乙酰乙酸盐、谷氨酰胺、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸／异亮氨酸、高密度脂蛋白(HDL)、不饱和脂肪酸、低密度脂蛋白／极低密度脂蛋白、多不饱和脂肪酸等代谢产物的含量降低。另外,由于乌头碱组中,乳酸、LDL／VLDL含量较高,而乙酰乙酸盐、血脂含量较低,使得其与新乌头碱和次乌头碱给药组有所偏离。对给药结束后各组大鼠血浆进行的GC／TOF-MS检测,可鉴定36种内源性代谢产物,包括氨基酸、脂肪酸、糖、有机酸等类物质。对其数据进行t检验和多元统计分析均显示,次乌头碱的毒性要显著低于乌头碱和新乌头碱,且代谢物谱的变化不同。3、甘草次酸和新乌头碱联合给药后,大鼠尿样NMR结果显示甘草次酸对新乌头碱的毒性具有缓解作用,且多次给予甘草次酸预保护的毒性缓解作用要优于甘草次酸单次预保护。主要表现在对肌酸／肌酐、2-酮戊二酸、乳酸、马尿酸、丙氨酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、DMG和甘氨酸的含量改变的调节上。给药后7d,大鼠血样的核磁测定结果显示,甘草次酸对新乌头碱致毒的大鼠血浆小分子代谢物谱产生的毒性作用具有缓解作用,且多次给予甘草次酸预保护的毒性缓解作用要优于甘草次酸单次预保护。主要表现在对丙氨酸、丙酮酸、TMAO、葡萄糖、脂类、乳酸、NAc、乙酰乙酸等代谢产物的含量的调节上。但对新乌头碱导致的血脂、血浆中脂肪酸及脂蛋白等代谢产物的毒性的缓解作用不明显。各组大鼠给药后7d的血浆样本在GC／TOF-MS检测中共鉴定出34个内源性代谢产物,对各大鼠的积分数据进行多元统计分析的结果显示甘草次酸对新乌头碱的毒性具有缓解作用。另外,从大鼠心组织脂提样本及脑组织水提样本的结果也可看出甘草次酸对新乌头碱毒性的缓解作用。4、干姜水煎液和甘草次酸、干姜水煎液与新乌头碱联合给药1d后大鼠尿样的NMR测定结果显示干姜水煎液及甘草次酸、干姜水煎液联合使用均对新乌头碱的毒性具有缓解作用。且甘草次酸、干姜水煎液联合使用对新乌头碱的毒性缓解作用更显著。主要表现在2-酮戊二酸、马尿酸、葡萄糖、牛磺酸、甘氨酸的含量改变的调节上。从给药1d后大鼠血样的NMR测定结果显示干姜水煎液及甘草次酸、干姜水煎液联合使用均对新乌头碱的毒性具有缓解作用,且缓解作用相近。主要表现在对丙氨酸、乳酸、乙酸、葡萄糖、脂类、NAc、OAc等代谢产物的含量改变的调节上。各组大鼠给药后1d的尿液样本在GC／TOF-MS检测中共鉴定出35个内源性代谢产物,对积分数据进行多元统计分析显示干姜水煎液及甘草次酸、干姜水煎液联合使用均对新乌头碱的毒性具有缓解作用。且甘草次酸、干姜水煎液联合使用对新乌头碱的毒性缓解作用更显著。主要表现在柠檬酸、甘露醇、苹果酸、马尿酸、2-酮戊二酸、十四烷酸、葡萄糖等代谢产物含量改变的缓解上。各组大鼠给药后1d的血浆样本在GC／TOF-MS检测中共鉴定出33个内源性代谢产物,对积分数据进行多元统计分析显示干姜水煎液及甘草次酸、干姜水煎液联合使用均对新乌头碱的毒性具有缓解作用。且甘草次酸、干姜水煎液联合使用对新乌头碱的毒性缓解作用更显著。主要表现在尿素、乳酸、磷酸、3-羟基丁酸、内消旋肌醇、葡萄糖等代谢产物的含量变化的缓解上。另外,从大鼠心组织及脑组织的水提、脂提样本的结果也可看出姜水煎液及甘草次酸、干姜水煎液联合使用均对新乌头碱的毒性具有缓解作用。5、首次建立了在相同条件下检测大鼠血浆及尿液的代谢物谱的GC／TOF-MS方法,并利用AMDIS系统建立了包含35个代谢产物的大鼠尿样GC／TOF-MS代谢产物谱库,及包含38个代谢产物的大鼠血样GC／TOF-MS代谢产物谱库,方便以后大鼠尿样、血浆GC／TOF-MS代谢物谱图的鉴定和纯化,可大大提高对TIC色谱图中谱峰鉴定的速度及准确度。结论：由本文研究结果可知,附子中代表性毒性成分乌头碱、新乌头碱、次乌头碱均可对大鼠代谢环境造成毒性作用。其中乌头碱的毒性最强,新乌头碱次之,次乌头碱最弱,并且次乌头碱的毒性作用机制与乌头碱及新乌头碱差别较大。三羧酸循环及其相关代谢途径,如：尿素循环均受到三种乌头类生物碱的毒性影响而发生一定程度的损伤。甘草中主要有效成分甘草次酸可缓解新乌头碱对大鼠的毒性作用,且多次给予甘草次酸预保护后的毒性缓解作用更显著。干姜水煎液也可缓解新乌头碱对大鼠的毒性作用,且干姜水煎液与甘草次酸联合使用对新乌头碱毒性的缓解作用更显著,并且这种缓解作用是通过对机体的代谢物谱的调节来实现的。另外,本文结果还表明,利用代谢组学方法可通过所得的与毒性相关的特征代谢物谱,结合模式识别方法分析相关特征性变化的代谢产物,从而探讨毒性作用及与其他药物合用而减毒的规律及机理。可见,代谢组学技术可为中药安全性评价提供有效的技术手段,具有较好的应用前景。