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李斯特菌是一类兼性厌氧、革兰氏阳性、呈杆状的细菌,广泛分布于环境、食品、人和动物宿主体内。迄今为止,李斯特菌属包括15个种Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria welshimeri, Listeria seeligeri和Listeria grayi是最常见的从食品、病人和环境中分离得到的六个种,被定义为常见李斯特菌种Listeria rocourtiae, Listeria weihenstephanensis, Listeria fleischmannii, Listeria marthii, Listeria floridensis, Listeria aquatica, Listeria cornellensis, Listeria riparia和Listeria grandensis是近年来命名的新种.常分离自然环境中,被定义为稀有李斯特菌种。李斯特菌的鉴定主要依赖传统方法,包括标本的增菌、分离培养以及后续的生化鉴定该方法耗、耗力、成本高：生化鉴定时,反应不稳定,结果判牍主观性强,导致鉴结果重复性差。为J了克服传统鉴定方法的不足,本研究建立了一个快速、准确的多重PCR(mPCR)检测方法。该mPCR方法包括一个属特异性基因和五个种特异性基因,在一个反应体系中同时鉴定李斯特菌的六个常见种。运用511侏李斯特菌和15株李斯特菌(包含十五个种)进行特异性评价,所有李斯特菌株被正确分类。该方法在实验室研究、临床诊断及疫情爆发溯源调查中具有重要的应用价值。在单增李斯特菌的13个血清型中,4b为优势致病血清型,引起人类李斯特菌病暴发和散发。4b血清型分为四个业型(ECⅠ、ECⅡ、ECⅣ、non-EC),不同的亚型在属主特异性、致病性及生物学特征上存在差异。本研究根据一个4b血清型特异基因利三个亚型特异基因,建立针对单增李斯特菌4b血清型四个亚型(ECI、ECII、ECIV、non-EC)的mPCR鉴定方法。建立的mPCR在一个反应体系中能同时鉴别ECⅠ、ECⅡ、ECⅣ、non-EC,并运用16株4b血清型单增李斯特菌进行特异性验证,16株4b血清型单增李斯特菌可用本方法进行分型：其中ECI亚型11株,ECII亚型1株,ECIV亚型2株,非流行克降群(non-EC)2株。本方法能准确鉴定单增李斯特菌4b血清型菌株的4个亚型,可用于食品、临床标本的病原学诊断和疫情暴发的溯源调查。单增李斯特菌根据分子特征和进化分析方法,可分为四个进化家系(Lineage Ⅰ、 Lineage Ⅱ、Lineage Ⅲ、Lineage Ⅳ)及两个亚系(Lineage ⅢA、Lineage ⅢC)。Lineage Ⅰ可引起人类李斯特菌病的散发和暴发, Lineage Ⅱ主要分布食品和环境中,Lineage Ⅲ A、Lineage ⅢC和Lineage Ⅳ 1要来自动物李斯特菌病病例和动物食品。本研究以一个单增李斯特菌种特异基因和四个家系特异基因设计引物,建立针对单增李斯特菌四个进化家系及两个亚系的mPCR鉴定方法,运用387株单增李斯特菌进行特异性验证,所有菌株均可用本方法进行所属家系和亚系的分型,包括Lineage Ⅰ246株、Lineage Ⅱ123株、Lineage ⅢA4株、Lineage ⅢC13株和Lineage Ⅳ 1株。本方法能准确鉴定单增李斯特菌的四个进化家系及两个亚系的菌株,可用于食品、临床标本中单增李斯特菌的病原学诊断和疫情暴发时的溯源调查。相对于传统的鉴定方法而言,mPCR省时、省力、检测成本低。然而,mPCR很难对原始增菌液进行快速检测、依赖于热循环设备、电泳耗时以及检测灵敏度差。介导等温扩增技术(LAMP)作为一种新的核酸检测手段,不依赖于设备,结果容易判读,广泛用于微生物领域的检测LAMP技术针对靶序列的八个区域设计三对引物,在一小时内扩增靶序列达109次拷贝,其特异性和敏感性都优于Real-time PCR和PCR技术。本研究根据伊氏李斯特菌特异基因smcl设计LAMP引物,建立Listeria ivanovii-LAMP扩增技术反应条件仅需64℃水浴1小时即可,检检测纯培养目的菌时,检测下限为250fg/反应管检测粪便模拟标本的检测下限为8×103CFU/g。与PCR及Real-time PCR方法相比较,LAMP方法的敏感性分别高出100和10倍L. ivanovii-LAMP引物专一性的扩增伊氏李斯特菌DNA模板,非伊氏李斯特菌株不出现阳性扩增为了使LAMP技术更广泛应用到诊断领域,本研究对传统LAMP技术进行改进,建立多内引物环介导恒温扩增技术(MI-LAMP)与传统LAMP技术相似,MI-LAMP技术反应条件仅需恒温水浴1小时即可,在检测纯培养目的菌时,检测下限为62.5fg/反应管,且阳性扩增仅需15分钟。与PCR方法相比较,MI-LAMP方法的敏感性高出400倍。此外,MI-LAMP引物专一性的扩增对应的靶序列,非靶序列不出现假阳性扩增。LAMP作为一种恒温扩增技术,在诊断领域的运用受限于单一靶标检测,为了获得多重LAMP检测,本研究建立了MERT-LAMP技术,实现LAMP技术的快速,敏感及多重实时检测。与传统LAMP技术相似,MERT-LAMP技术反应条件仅需恒温水浴1小时即可,在检测纯培养目的菌时,检测下限为250fg/反应管,且阳性扩增仅需12分钟。实现多重检测和单一目标检测时,其敏感性不受影响。与PCR为基础方法相比较,MERT-LAMP方法比普通PCR敏感100倍,比Real-time PCR方法敏感100倍。此外,MERT-LAMP引物专一性的扩增对应的靶序列,非靶序列不出现假阳性扩增。为了丰富食源性病原体单增李斯特菌的诊断体系,CPA技术被用于检测单增李斯特菌,建立L. monocytogenes-CPA扩增技术。与其他恒温技术相似,L. monocytogenes-CPA反应条件仅需恒温水浴1.5小时即可,然而,CPA的引物设计简单,对靶序列保守性要求较低。在检测纯培养单增李斯特菌时,检测下限为2.5 pg/反应管,最快阳性扩增需25分钟。与PCR为基础方法相比较,L. monocytogenes-CPA方法比普通PCR敏感10倍。此外,L. monocytogenes-CPA引物专一性的扩增对应的靶序列,非靶序列不出现假阳性扩增。在本研究论文中,建立了诊断李斯特菌的核酸检测体系及具有应用价值的新型恒温检测技术,实现对李斯特菌的快速,特异,敏感及多重检测。为食源性疾病的筛查、临床诊断及疫情暴发溯源调查提供有价值的分子诊断技术。