研究背景DNA和生化标志物在生命科学中发挥着越来越重要的作用,广泛应用于临床诊断、环境监测、食品安全和农作物保护中。目前,DNA和生化标志物的检测仍然主要依赖于现代化的实验室环境、昂贵的仪器设备和专业的操作人员,这限制了DNA和生化标志物检测在疾病现场或资源有限地区的应用。即时检测(Point-of-care testing,POCT)具有快速、简便、高度集成,不依赖大型仪器设备和专业工作人员等优点,在资源有限的地区具有巨大的潜力。但是现有的即时检测技术仍然存在以下限制:首先大部分设备只能实现一个或几个环节上的POCT,如核酸扩增或结果读取,无法全流程地完成“sample-to-answer”的检测;其次即时检测设备往往只针对一种或少数几种DNA靶标类型和样本来源,无法实现多用途的平台式检测。综上,本研究在即时检测技术现有发展基础上,针对DNA和生化标志物,建立了全新的智能即时检测平台(intelligent Point-of-care testing,i POCT),并对其临床应用性能进行了系统的评价,对即时检测平台的深入开发和转化提供了一定的研究基础。研究目的1.建立超便携、多功能的DNA智能即时检测平台;2.对DNA智能即时检测平台的临床应用性能进行评价;3.建立生化标志物智能即时定量检测平台;4.对生化标志物智能即时定量检测平台的临床应用性能进行评价。研究方法1.采用3D打印技术和微流控技术,设计构建包含3D打印前处理单元和微流体信号放大单元的集成芯片。设计可折叠支架,并搭建手机光路系统。设计智能手机应用程序,开发智能手机温控系统和结果读取系统。利用恒温重组酶聚合酶扩增与金-银纳米颗粒结合的方法,构建i RPAS(isothermal Recombinase Polymerase Au-Silver,iRPAS system)三重信号放大系统。利用地中海贫血全血样本、细菌感染尿液样本、唾液样本,测试DNA智能即时检测平台对不同类型的基因突变、尿液细菌感染和单核苷酸多态性(SNP)的检测效果。利用细菌污染牛奶样本、细菌污染河水样本、细菌感染植物叶片样本,测试DNA智能即时检测平台对食品样本、环境样本和农作物样本的检测效果。2.通过恒温烘箱模拟不同环境温度测试智能手机温控系统在极端环境下的检测效果和电池耗电量。构建基因突变质粒,通过质粒DNA进行检测平台灵敏度和理论检测下限测定。通过每周测定常温放置的i-chip,分析i-chip在没有冷链保存情况下的稳定性。通过比较受过训练与未受过训练的用户组间的检测效果,分析检测平台的易操作性。通过使用不同品牌的智能手机测试DNA检测平台在不同品牌智能手机间的稳定性。通过检测172例临床样本,分析平台对不同类型基因突变、SNP、细菌检测的准确性、阳性预测值、阴性预测值。3.利用侧向层析技术和3D打印技术构建血浆分离模块,通过显微镜观测血浆分离模块对血浆的分离效果。利用3D打印技术构建检测模块,通过不同浓度血清化学质控品进行生化反应,分析检测模块的稳定性。利用智能手机环境光传感器并设计相应应用程序进行透射光强度的记录和浓度换算。4.使用血清化学质控品测定即时生化标志物智能定量检测平台对总胆红素和直接胆红素的线性范围和检测灵敏度。通过血液中10种干扰生化标志物来分析检测平台的对总胆红素和直接胆红素的检测特异性。通过真实血浆中掺入血清生化质控品,来评估检测平台的回收率。通过检测19份临床血液样本,验证检测平台在临床全血样本中对总胆红素和直接胆红素的定量性能,并与全自动临床化学分析仪进行比对。通过使用Passing-Bablok回归、Bland-Altman差异图分析和Kappa检验分析平台与临床化学分析仪的相关性和一致性。研究结果1.通过3D打印技术和微流控技术建立了由i-chip和f-box组成的POCKET DNA检测平台。平台重量不足100 g,长度小于25 cm。建立并优化了i RPAS三重信号放大系统,iRPAS结果可通过智能手机进行半量化分析。搭建了智能手机温控系统,并设计了在寒冷环境下使用的保温袋。POCKET DNA检测平台在检测各种类型的基因突变、SNP、细菌感染时,阳性标本和与对照组之间有明显的信号差异(p<0.05)。POCKET DNA检测平台在检测血液、尿液、唾液、牛奶、河水、树叶时,实验组与对照组之间有明显信号差异(p<0.05)。2.智能手机温控系统在不同的环境温度下(4°C、15°C、25°C、37°C)达到并维持37°C所需的时间均不超过20 min,并且在所有测试温度下均获得显著的强信号。手机电量至少可以完成四次完整检测。DNA智能即时检测平台检测下限在10~3-10~4copies/m L左右,计算可得理论灵敏下限为113 copies/m L。i-chip在10周的观察时间内检测效果保持稳定。训练与未经训练的用户检测效果类似,没有显著差异。使用三个不同品牌的智能手机得到的检测结果之间也没有显著差异。POCKET平台用于临床样本检测的总准确度为97.1%,每个靶标AUC都超过0.950,特异性均大于77.8%,PPV大于88.2%。3.通过侧向层析技术和3D打印技术成功构建了包含血浆分离模块和检测模块的即时生化标志物智能定量检测平台,平台总重量不足40 g,成本不足5美元,整个检测周期小于5 min。在血浆分离试纸条尾部血浆分离效果最好,可用于后续血浆转运。无论是高、中还是低浓度,检测模块在30 min观察时间内均非常稳定。设计的“Light to Concentration”智能手机应用程序,可对智能手机环境光传感器光强度值进行读取和记录并将其转换为生化标记物的浓度。4.总胆红素在1.0μM至30.3μM范围内具有良好的线性回归,检测下限为0.8μM,校准曲线回归方程为y=10.86*ln(x)+4.17。直接胆红素线性回归范围为0.7μM至21.3μM,检测下限为0.5μM,校准曲线回归方程为y=19.5*ln(x)+15.00。血液中10种检测波长接近胆红素的生化标志物在总胆红素和直接胆红素检测中光强度信号没有显著变化。与总胆红素和直接胆红素的光强度信号之间有显著差异。总胆红素和直接胆红素的平均回收率均高于95%。总胆红素的准确性为89.5%,阳性预测值为100.0%,阴性预测值为84.6%。直接胆红素的准确性为94.7%,阳性预测值为90.0%,阴性预测值为100.0%。Passing-Bablok回归分析、Bland-Altman差异图分析和Kappa检验都表明,我们的平台与临床化学分析仪具有良好的相关性和一致性。研究结论1.我们建立了一个超便携、多功能的DNA智能即时检测平台。首先,该平台具有超便携的特点,整个平台重量小于100 g,体积小于1 L,从样本制备到信号放大到结果读取全流程无需仪器设备。我们开发了i RPAS三重信号放大技术和智能手机温控系统。智能手机可作为温控系统、信号检测器和结果读数装置,从而实现了恶劣环境下也可以进行即时DNA扩增。其次,该平台具有多用途的特点,从临床样本(血液、尿液和唾液),环境样本(河水),食品(牛奶),农业样本(植物叶片)等各种样本来源中检测了不同类型的DNA包括各种类型的基因突变、SNP、细菌DNA。2.我们的平台在不同的环境温度下均能良好运行。平台检测灵敏、特异(单碱基特异性)、快速(<2 h)、稳定(在室温下至少保存10周),用户友好、兼容不同品牌智能手机。通过分析并测定了172份临床样本,证明我们的平台对于基因突变、细菌感染和SNP检测均有极佳的检测性能。3.我们建立了一个即时生化标志物智能定量检测平台,实现了全血样本中sample-to-answer的生化标记物定量检测。平台集成了血浆分离模块和检测模块。血浆分离模块实现了快速血浆分离。检测模块实现了无需移液器进行生化反应。通过智能手机环境光传感器和我们设计的应用程序,实现了光强度值的读取和记录并将其转换为生化标记物的浓度。通过总胆红素和直接胆红素我们验证了平台的可行性。4.即时生化标志物智能定量检测平台具有很好的便携性(<40 g),低成本(<5美元),快速(<5 min),无需仪器,高灵敏度(<1μM)。并且我们平台具有较好的特异性和回收率。通过分析并测定了19份临床样本并与全自动临床化学分析仪进行比对。我们的平台对临床样本的定量性能与临床化学分析仪具有较好的一致性。