论文部分内容阅读
本文研究了C-型凝集素对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）免疫作用调节机制的影响。主要探讨了（1）凡纳滨对虾C-型凝集素的原核表达；（2）脂多糖、重组C-型凝集素蛋白对凡纳滨对虾血细胞酚氧化酶原激活系统和信号传导的影响；（3）哈维氏弧菌、重组C-型凝集素对凡纳滨对虾酚氧化酶原激活系统和信号传导的影响；主要结果如下：1凡纳滨对虾C-型凝集素基因的原核表达和活性检验本文根据凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）C-型凝集素基因（C-lectin）cDNA序列设计引物，构建C-型凝集素基因原核表达载体，实现了该基因在大肠杆菌（Escherichia coli）中的原核表达，并检测了重组C-型凝集素的免疫活性。结果表明：重组C-型凝集素经SDS-PAGE分析显示在39kD处有显著诱导条带，与预测的分子量大小基本一致，Western blot分析可以与anti-His抗体特异性结合，从而证明C-型凝集素重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。重组C-型凝集素对小鼠和兔的红细胞没有明显的凝集作用，而对所选5种细菌的凝集作用存在差异，其中对大肠杆菌具有明显的凝集作用，而对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和金黄色葡萄球菌均无凝集现象。2重组C-型凝集素对凡纳滨对虾血细胞免疫作用的研究本文采用血细胞悬浮培养的方法，研究了重组C-型凝集素对凡纳滨对虾血细胞免疫作用的影响。实验梯度设置为：对照组、重组C-型凝集素蛋白组（Lvlec，1mg/mL）、脂多糖组（LPS,1.0mg/L）、脂多糖+重组C-型凝集素蛋白（LPS+Lvlec，1.0mg/L+1mg/mL），分别在0、3、6、9、12、24h取培养的血细胞和培养液进行免疫相关指标的测定。结果表明：重组C-型凝集素对凡纳滨对虾血细胞数量、存活率和吞噬率、凝集活力影响显著（P<0.05）；各处理组培养液酚氧化酶活力在培养3-12h内呈峰值变化，于9h时达到最大值（P<0.05）。血细胞cGMP含量、PKA活力在3-12h内呈峰值变化，各处理组均于9h时达到最大值，然后均恢复至对照组水平。由此可见，LPS、Lvlec对凡纳滨对虾血细胞具有明显的免疫调控作用，能激活酚氧化酶原系统，引发一系列免疫防御反应。3注射重组C-型凝集素对凡纳滨对虾免疫防御机制的影响本文采用人工注射的方法，研究了重组C-型凝集素对凡纳滨对虾免疫作用的影响，实验梯度设置为：对照组、重组C-型凝集素蛋白（Lvlec protein，1.0mg/mL）、哈维氏弧菌组（V. harveyi，10~6cfu/mL）、哈维氏弧菌+重组C-型凝集素蛋白（V. harveyi+Lvlec protein，10~6cfu/mL+1.0mg/mL）处理组，分别在0、3、6、9、12、24h取样品测定。结果表明：注射哈维氏弧菌悬液和重组C-型凝集素蛋白对凡纳滨对虾血细胞数量、血细胞酚氧化酶原、酚氧化酶活力、凝集活力、吞噬率、溶菌活力和cGMP含量、PKA活力影响显著（P<0.05），而对照组无显著变化。结果表明：V. harveyi、Lvlec对凡纳滨对虾血细胞具有明显的免疫调控作用，引发一系列免疫防御反应。注射V. harveyi、Lvlec后cGMP含量、PKA活力和胞吐的酚氧化酶（PO）活力表现出明显的时间效应性，显著增强了血细胞的凝集活力、吞噬作用和溶菌活力，具体作用途径为Lvlec→cGMP→PKA→PO→吞噬、凝集作用、溶菌活力，而且LPS和Lvlec具有基本相同的调控途径。