背景：获得性再生障碍性贫血(aplastic anemia, AA)为一类以全血细胞减少和骨髓造血衰竭为特征的自身免疫性疾病。免疫介导的造血抑制是AA的主要发病机制。1 a,25-二羟维生素D3 [1a,25-Dihydroxyvitamin D3,1,25(OH)2D3]为维生素D的活性形式,除了调节机体钙磷代谢外,近期研究发现其与维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)结合后尚可发挥免疫调节效应。已有研究证实1,25(OH)2D3和VDR在多种自身免疫性疾病发生发展中发挥关键作用,但其在AA发病机制中的作用尚未明确。目的：本研究旨在检测1,25(OH)2D3和VDR在AA患者中的表达,同时评价1,25(OH)2D3对AA患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)的作用,探讨其在AA发病机制中的作用,为AA的免疫抑制治疗提供新的思路。方法：(1)通过ELISA方法检测血浆中25(OH)D3的表达,并进一步分析25(OH)D3水平与AA患者各临床参数之间的关系；(2)通过实时定量PCR的方法检测PBMCs以及1,25(OH)2D3处理后的PBMCs中VDR mRNA的表达水平；(3)通过CCK-8的方法检测1,25(OH)2D3对PBMCs增殖的影响；(4)将患者PBMCs用1,25(OH)2D3处理,未处理组作为对照。48小时后,采用ELISA的方法检测培养上清中TNF-α IFN-γ IL-17A、IL-10和TGF-β1的水平变化,实时定量PCR的方法检测T细胞相关转录因子T-bet. GATA3. RORyt和Foxp3 mRNA的表达变化,同时采用流式细胞术的方法检测1,25(OH)2D3处理的PBMCs内Thl (CD3+CD8-IFNy+)、Th2 (CD3+CD8-IL4+)、Tcl (CD3+CD8+IFNγ+)、Tc2 (CD3+CD8+IL4+)和Th17 (CD3+CD8-IL17+)细胞的比例变化。结果：(1)初治AA患者血浆25(OH)D3的水平与完全缓解患者、正常对照组无显著差异；(2)AA患者血浆25(OH)D3的水平与血小板计数、自然杀伤T细胞(natural killer T cells, NKT)比例呈显著正相关,与B细胞比例呈负相关；(3)初治AA患者PBMCs VDR mRNA表达水平显著低于正常对照组；(4)体外刺激实验显示1,25(OH)2D3抑制AA患者PBMCs的增殖;(5)外源性1,25(OH)2D3的加入明显抑制AA患者PBMCs分泌TNF-α、IFN-γ和IL-17A,并促进TGF-β1的产生；(6)1,25(OH)2D3抑制Th1、Tc1和Th17细胞的极化,同时促进Th2和Tc2细胞的极化,实时定量PCR的结果进一步证实1,25(OH)2D3抑制AA患者PBMCs内T-be、RORyt mRNA的表达,同时促进GATA3、Foxp3 mRNA的表达；(7)1,25(OH)2D3处理后正常对照组PBMCs中VDR mRNA的表达水平明显上调,AA患者却无明显变化。结论：初治AA患者PBMCs中VDR表达水平明显降低,低表达的VDR可能使维生素D-VDR通路信号传导减弱,从而导致AA的“高免疫”状态。适量的补充维生素D可通过增强信号传导来部分纠正AA免疫失耐受,有望成为一种新的辅助性治疗策略。背景：再生障碍性贫血(aplastic anemia, AA)是一种少见的可严重危及患者生命的骨髓衰竭性疾病,目前对其发病机制的研究主要集中在免疫调节紊乱、造血微环境缺陷、造血干/祖细胞数量和(或)功能缺陷及遗传易感性等方面。维生素D具有重要的免疫调节作用,其效应的发挥依赖于与维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)的结合。VDR基因位于第12号染色体,包含多个单核苷酸多态性(SNP)位点。研究发现,VDR基因及其多态性与多种自身免疫性疾病的易感性相关。目前关于VDR基因多态性是否与AA发病相关尚未见报道。目的：本研究旨在探讨VDR基因四个多态性位点(rs2228570、rs1544410、rs7975232和rs731236)与AA易感性的关系,并评价VDR基因多态性与AA严重程度、治疗疗效及晚期克隆演变等临床特征的相关性。方法：采集AA患者和正常对照的外周血并提取DNA,采用聚合酶链反应-连接酶检测反应(PCR-LDR)的方法检测197例AA患者和135例健康对照rs1544410 (c.1024+283G>A)、rs7975232 (c.1025-49G>T)和rs731236(c.1056T>C)的基因型。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测rs2228570(c.2T>C)的基因型。应用SPSS 17.0软件统计分析VDR基因多态性位点与AA易感性、疾病严重程度、治疗疗效、克隆演变及其他临床特征的相关性。结果：(1)VDR基因四个多态性位点的基因型均符合Hardy-Weinberg平衡。(2)VDR基因rs1544410、rs7975232和rs731236三个位点之间存在显著的遗传连锁不平衡。 (3)在VDR基因的四个多态性位点中,AA患者rs1544410位点GG基因型和G等位基因频率显著高于正常对照组,而其他三个多态性位点与AA易感性无关。 (4)进一步分析发现rs1544410和rs7975232位点与非重型AA的发病相关,而rs2228570位点与重型AA的发病相关。 (5)AA患者rs2228570位点的基因型与治疗疗效相关：CC及CT基因型患者预后好于TT基因型者。(6)AA患者rs2228570位点的基因型与晚期克隆演变亦密切相关：TT基因型携带者更易于转化为骨髓增生异常综合征／急性髓系白血病,而CT基因型患者更易进展为阵发性睡眠性血红蛋白尿症。结论：我们的研究结果表明,在中国人群中,VDR基因多态性与AA的易感性、疾病严重程度及预后密切相关。背景：获得性再生障碍性贫血(aplastic anemia, AA)是一种自身反应性T细胞攻击靶器官骨髓所致的骨髓衰竭性疾病。IL-35为近年新发现的一种调节性细胞因子,是IL-12家族的新成员,主要由调节性T细胞(Tregs)分泌产生。目前认为IL-35为Tregs发挥免疫抑制作用的主要效应分子。此外,IL-35尚可诱导T细胞分化为可分泌IL-35的诱导型调节性T细胞(iTR35),进一步维持机体的免疫耐受状态。越来越多的证据表明IL-35在调控机体免疫稳态中发挥关键作用,但其在AA中的表达情况以及是否参与AA的发病机制尚未明确。目的：本研究旨在检测AA患者血浆中IL-35的表达情况,并评估IL-35对T细胞免疫反应的作用,探讨其在AA发病机制中的作用,为基于IL-35的靶向治疗提供理论依据。方法： (1)收集患者临床资料；(2)通过ELISA方法检测血浆中IL-35的表达,并进一步分析IL-35水平与AA患者各临床参数之间的关系; (3)通过实时定量PCR的方法检测外周血单个核细胞(PBMCs)中IL-35两个亚基p35和EBI3 mRNA的表达水平； (4)通过Brdu掺入法检测IL-35对PBMCs增殖的影响；(5)将患者和正常对照PBMCs用IL-35处理,未处理组作为对照。48小时后,采用ELISA的方法检测培养上清中TNF-α IFN-γ、IL-17A. IL-10和TGF-β1的水平变化,流式细胞术和细胞计数相结合的方法检测CD4+/CD8+T细胞、Thl (CD3+CD8-IFNy+)、Th2 ( CD3+CD8-IL4+)、Tcl (CD3+CD8+IFNy+)、Tc2 (CD3+CD8+IL4+)和Th17 ( CD3+CD8-IL17+)细胞的比例和绝对数变化,同时采用实时定量PCR的方法检测T细胞相关转录因子T-bet、GATA3、RORγt和Foxp3 mRNA的表达变化。结果：(1)通过ELISA检测,我们发现初治AA患者血浆中IL-35的水平明显低于完全缓解(CR)患者和正常对照组,而CR患者和正常对照组之间无显著差异,进一步分析发现IL-35水平与疾病的严重程度密切相关。(2)在初治AA患者,血浆IL-35的水平与血小板计数、中性粒细胞绝对值和网织红细胞绝对值呈显著正相关,与淋巴细胞比例呈负相关。(3)实时定量PCR的结果显示,初治重型AA患者p35和EBI3 mRNA表达水平低于正常对照组,而初治非重型AA与正常对照组之间无显著差异。(4)体外刺激实验显示IL-35能抑制AA患者PBMCs的增殖,进而行细胞计数和流式细胞术发现IL-35能抑制CD4+和CD8+T细胞的增殖。(5)外源性IL-35的加入明显抑制AA患者PBMCs分泌TNF-α IFN-γ和IL-17A,同时促进TGF-β的产生。(6)IL-35抑制Th1、Tcl和Th17细胞的极化,同时促进Th2和Tc2细胞的极化,实时定量PCR的结果证实IL-35抑制AA患者PBMCs内T-bet和RORyt mRNA的表达,同时促进GATA3 mRNA的表达,对Foxp3 mRNA的表达无明显影响。结论：初治AA患者体内IL-35的表达水平降低,且与疾病严重程度密切相关,IL-35低表达可能致使Tregs失能,进而导致AA的免疫失耐受状态,提示IL-35在AA的发病机制中发挥关键作用。