论文部分内容阅读
钙流失已成为当今全球性的健康问题,无机钙盐被摄入体内在肠道中易与植酸、草酸和磷酸等形成不溶性盐,导致钙的生物利用率下降,而有机钙由于其独特的螯合、转运机制更易被吸收利用。乳清蛋白是酪蛋白生产加工过程中残留下来的乳清中所含的蛋白质,其酶解产物具有一定的钙螯合活性。本研究提出从乳清蛋白酶解产物中分离纯化出特异性的钙螯合肽,并通过结构性质鉴定对螯合物的作用机理进行了深入研究,为将来第三代补钙剂的生产应用奠定了基础。本课题致力于乳清蛋白钙螯合肽的制备、分离纯化与表征的研究。采用复合蛋白酶与复合风味蛋白酶对乳清蛋白进行酶解,得到的酶解产物经钙螯合力测定其活性为33.92μg/mg,命名为WPH(Whey protein hydrolysate)。利用DEAE-650M阴离子交换色谱、Sephadex G-25凝胶过滤色谱、C18反相高效液相色谱(RP-HPLC)对乳清蛋白酶解产物进行分离,得到四个特异性的钙螯合肽,分别命名为WPH1A1、WPH1A2、 WPHIB 和 WPH2。WPH1A、WPHIB 与 WPH2的钙螯合活性分别为73.34μg/mg、79.51μg/mg与67.81μg/mg,与乳清蛋白酶解产物相比钙螯合力分别提高了116.21%、]34.38%和99.88%。经液质联用仪鉴定,结果表明四条肽的分子量分别为237.99Da、279.97Da、396.98Da 和 204.10Da,对应的氨基酸序列分别为Gly-Tyr(GY)、 Phe-Asp(FD)、Tyr-Asp-Thr(YDT) 和 Glu-Gly(EG)。采用紫外光谱扫描、荧光光谱、红外光谱扫描、核磁共振一维氢谱、X射线衍射、TG-DSC、Zeta电位和钙离子释放率等表征手段分析肽钙螯合物性质,探究钙螯合肽GY、FD、YDT和EG与钙离子的作用位点,并分析螯合物的pH稳定性及热稳定性等理化性质。结果表明,乳清蛋白多肽经分离纯化得到的钙螯合力肽与钙离子螯合方式可能是一个或多个钙螯合肽将一个钙离子包裹在中央,形成五元环或六元环结构,参与螯合反应的氨基酸包括谷氨酸(G1u)、天冬氨酸(Asp)和甘氨酸(G1y),肽键中的羰基(-C＝O)和亚氨基(-NH)也参与螯合反应,主要结合位点是羰基氧和氨基氮。肽钙螯合物pH稳定性和热稳定性较好,钙离子释放率实验结果表明肽钙螯合物在人体碱性肠道环境下稳定,不易产生沉淀,有利于吸收转运。通过以上实验得出结论：从乳清蛋白酶解产物中分离纯化得到的钙螯合二肽GY、FD、EG和三肽YDT具有较强的钙螯合活性,与钙离子生成的肽钙螯合物表现出较好的pH稳定性、热稳定性和钙离子释放率。如果将其进行工业化生产,有很强的第三代补钙剂开发潜质。