抑郁症是一种常见的疾病,也是情绪障碍的主要类型之一。这种疾病以显著而持久的心境低落为主要临床特征。根据病情的严重程度,抑郁的症状可以从心情上的失落、悲伤和沮丧到行为意识上的障碍,甚至导致自杀行为的发生。此外,抑郁症的发作还可能伴有精神疾病的症状,如幻觉和妄想;神经疾病的症状,如注意力受损、认知障碍和记忆丧失;或躯体障碍的症状,如言语缓慢和减少、食欲不振、体重减轻和柔韧性降低等。根据WHO（世界卫生组织）在2017年世界卫生日的数据报告,抑郁症给全世界超过3亿人带来了身心上的痛苦,且每年有近80万人因此而自杀。从2005年到2015年,抑郁症患者的比例增加了18%。抑郁症作为世界第四大疾病,已在全球范围内造成严重的疾病负担和经济负担,构成人类健康的重大威胁。根据诱发原因和临床症状,抑郁症还可分为多种亚型,包括内源性因素导致的严重抑郁症;抑郁和躁狂情绪交替发作的双相情感障碍;以精神症状为主的精神性抑郁症,孕期或分娩后发生的产前/产后抑郁症;以某些疾病作为诱因而并发的继发性抑郁症以及因冬季光照减少而发作的季节性抑郁症。目前,针对抑郁症的治疗主要包括三种方式,即心理治疗、药物治疗（主要包括各类多巴胺、五羟色胺和去甲肾上腺素等神经递质的再摄取抑制剂）和神经刺激治疗。然而,现有的三种治疗方案针对患者的治疗有效率及临床治愈率仍显著低于其它慢性疾病,且治疗后复发率依旧很高。目前,对于抑郁症的病因尚无明确定论。但不可否认的是,抑郁症是复杂的多因素相互作用的结果。许多研究已经表明慢性应激在这种疾病的发生发展过程中起着关键性作用,因此抑郁症也常被认为是一种与精神及心理压力有关的疾病。最新的研究结果表明,应激反应与多种生理病理机制有关,长期或严重的精神及心理压力是抑郁症发病和复发的主要原因。慢性应激,作为抑郁症的主要触发因素之一,可影响神经内分泌的稳态和自主神经的调节,导致大脑的神经可塑性降低,对应激反应的维持能力减弱,最终导致抑郁症。尽管慢性应激如何导致抑郁症的机制研究已进行了几十年,但至今无明确结论。但令人欣慰的是,许多研究结果已证实神经炎症的发生在慢性应激诱发抑郁症的过程中扮演了至关重要的角色。小胶质细胞是存在于中枢神经系统的一类巨噬细胞,是大脑应对创伤、炎症、感染或神经系统疾病的第一道免疫防线。小胶质细胞具有高度的形态可塑性,约占大脑细胞总数的12%。正常情况下,小胶质细胞在静息状态下具有胞核较小且多突触的高分支形态,此时的小胶质细胞对神经系统的微环境具有高度的监测功能。当有创伤、炎症、感染或疾病发生于中枢神经系统后,小胶质细胞可被迅速激活并发生胞体增大,突触缩短的形态学变化,同时分泌多种促炎性细胞因子、激活吞噬功能,从而导致周围神经元的功能障碍和死亡,加速疾病的恶化进程进程。相关研究表明,激活的小胶质细胞数量在抑郁症患者脑中显著增加,这表明激活的小胶质细胞可能是介导抑郁症神经炎症的关键因素。非甾体抗炎药（NSAIDs）是一类具有抗炎、镇痛和解热作用的药物,其主要的临床适应症包括痛风、骨关节炎、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎和急慢性肌肉骨骼疼痛等。非甾体抗炎药主要通过抑制环氧合酶（COX）的活性来抑制炎症介质前列腺素（PGS）的合成。现有研究已表明,炎症反应参与了阿尔茨海默症与帕金森病的神经病变过程,且这些炎症刺激主要来自于大脑中激活的小胶质细胞。据研究报道,非甾体抗炎药在脑中风的治疗中发挥了神经保护作用,在阿尔茨海默症的治疗中有效延缓了病情的恶化。研究表明,生活失意或挫败经历造成的神经心理压力可以通过调节中枢神经系统中促炎性细胞因子的表达水平来增强神经炎症的活性,而由压力引发的炎症反应反过来又推动了抑郁症的进一步发展,并由此导致抑郁症患者行为上的初期症状的产生。促炎性细胞因子的异常表达,如白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和C反应蛋白（CRP）都在抑郁症的发生发展过程中起着重要作用,而这也再次印证神经炎症是诱发抑郁症和推进病程发展的重要环节。而抗炎药物则可以通过抑制小胶质细胞的过度激活而在延缓或预防抑郁症的发展中发挥出至关重要的作用。甲芬那酸（MA）,（2’,3’）-二甲基-N-苯基-氨基苯甲酸,是非甾体类抗炎药的一种。作为COX的非选择性抑制剂,具有持久的解热抗炎作用。临床上主要用于缓解软组织、骨损伤或关节炎产生的轻中度疼痛。有研究发现,COX-2参与了脑缺血时神经元死亡的过程,而COX抑制剂（包括MA）则在其中发挥了神经保护作用,表现为显著减少脑缺血的梗死体积。这充分表明,MA的神经保护作用可能是治疗慢性抑郁症中神经炎症的有效化合物。在本项研究中,我们探究了在慢性应激所诱发的抑郁症模型中,MA对小胶质细胞的激活是否具有抑制作用,并进一步确定MA发生相关作用的信号通路。实验结果表明,在慢性抑郁的小鼠模型中,MA通过抑制海马齿状回区域的小胶质细胞激活来发挥神经保护作用。此外,在内毒素脂多糖（LPS）诱导的BV2细胞（永生化小胶质细胞）炎症模型中,MA可以通过抑制ERK1/2（p42/p44有丝分裂原活化蛋白激酶）和p38 MAPK（p38有丝分裂原活化蛋白激酶）的活化来抑制小胶质细胞的激活,并通过抑制paxillin蛋白在Ser83位点的磷酸化来抑制激活小胶质细胞的吞噬作用,从而发挥其神经保护作用。为了探究MA对抑郁症伴随的行为障碍是否具有改善作用,我们采用了两种行为学试验方法进行探究,分别是蔗糖偏好试验和强迫游泳试验。C57BL/6小鼠随机分为五组,分别为空白对照组、慢性应激组、慢性应激+MA（5mg/kg）治疗组、慢性应激+塞来昔布（阳性对照,10mg/kg）治疗组和单纯MA（5mg/kg）给药组。需给予慢性应激的小鼠在每天置于以下1-2种不可预测应激源的环境中:包括24小时的食物剥夺、24小时的引用水剥夺、24小时的潮湿垫料、24小时的成对饲养,将老鼠束缚在在50毫升离心管中30分钟、摇动饲养笼15分钟以及将老鼠置于充满排泄物的脏笼子中24小时。在持续28天的慢性应激开始前和结束后进行行为学实验,并每周记录小鼠体重。结果表明,五组小鼠在实验期间体重无显著差异,说明慢性应激对体重无影响。而在蔗糖偏好试验和强迫游泳试验中,相比于慢性应激开始前,慢性应激组小鼠的蔗糖溶液摄取量显著降低、在水中的静止时间显著增加,而其他四组小鼠的蔗糖溶液摄取量和水中的静止时间无明显差异。这表明着MA和塞来昔布均能有效地改善慢性应激导致的小鼠兴趣缺失和绝望行为。在此基础上,我们猜测MA改善慢性应激导致的小鼠行为障碍是由于抑制海马齿状回区域中小胶质细胞的激活而产生的神经保护作用。为了观察和量化激活的吞噬性小胶质细胞,制备了五组小鼠海马背侧、中侧和腹侧部分的冷冻切片,并用Iba1（一种在小胶质中特异性表达的蛋白质）和CD68（一种在活化的小胶质细胞中高度表达跨膜糖蛋白）抗体对海马齿状回区域进行了免疫荧光染色。实验结果表明,在慢性应激组小鼠的背、中、腹侧海马的齿状回区域,激活的小胶质细胞数量均显著增加。而在经MA和塞来昔布治疗后的小鼠中,激活小胶质细胞数量显著降低,说明MA和塞来昔布均能有效抑制由慢性应激导致的海马齿状回区域小胶质细胞的激活。ERK1/2的激活被报道为小胶质细胞激活的生物标志物,磷酸化p38 MAPK的水平在炎症发生时显著升高,而LPS是导致炎性脑损伤和一系列炎性细胞因子水平变化的经典触发物。为了验证MA对小胶质细胞的炎性激活是否有抑制作用,在LPS（100ng/m L）作用下,用浓度分别为1μM、5μM和10μM的MA处理静息状态的BV2细胞6小时,采用蛋白免疫印迹法（Western blot）测定磷酸化ERK1/2和磷酸化p38 MAPK的蛋白水平。结果表明,MA可以抑制由LPS诱导而上调的ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化水平,且抑制作用呈浓度依赖式下降（图3）。此外,受p38 MAPK信号通路控制的i NOS（诱导型一氧化氮合酶）的表达也被MA以浓度依赖性的方式抑制（图3B和C）。综上结果,MA可有效抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞激活和炎症反应的恶化。MA是一种非选择性COX抑制剂,而在炎症过程中,COX-2是花生四烯酸合成PGs的限速酶。合成的PGs被释放到细胞外液中,然后通过四种G蛋白偶联受体（EP1-4）转运到自身和周围的细胞内,从而加剧炎症的进一步发展。在多种PGs的亚型中,前列腺素E2在炎症中的作用得到了更为广泛的研究。PGE2可以通过调节下游的分解代谢（如刺激NOS）来参与致炎致痛的炎症效应。为了验证MA是否具有除PGE2途径以外发挥非靶向效应的可能性,我们测试了PGE2受体拮抗剂是否对小胶质细胞的激活有额外的抑制作用。静息状态的BV2细胞分别在5μM MA和100ng/m L LPS作用下用1μM ONO-8130/1μM PF-04418948/1μM MF498（分别是EP1、2和4的选择性拮抗剂）处理6小时。结果显示,EP1、EP2和EP4拮抗剂均显著抑制了LPS诱导的ERK1/2和p38 MAPK的激活和i NOS表达水平的升高,但MA和拮抗剂之间并没有观察到协同效应（图4）,表明MA仅通过降低COX活性而发挥炎症抑制作用。塞来昔布（一种选择性COX-2抑制剂）已被证实可以降低人类骨关节炎软骨细胞中激活的ERK1/2和p38 MAPK的水平。随后又有研究表明,塞来昔布可抑制LPS诱导的小胶质细胞中IL-1β和TNF-α的增加,从而缓解脑部炎症。为了验证MA和塞来昔布是否通过同一信号通路来缓解LPS诱导的炎症反应,在100ng/m L LPS作用下分别或联合使用5μM MA和5μM塞来昔布处理BV2细胞6小时（图5）。实验结果显示,MA和塞来昔布可分别抑制LPS诱导的小胶质细胞的激活,但两者并未产生协同作用。这提示MA和塞来昔布在抑制神经炎症方面,发挥作用的信号途径是相同的。吞噬作用是抵抗外来病原体的一种基本免疫防御机制。它涉及细胞骨架的重塑和多种信号转导等一系列复杂的过程。研究已证实,p38 MAPK通过调节丝状肌动蛋白的动力学反应从而参与吞噬作用的防御机制。Paxillin是p38-MAPK的下游蛋白,它在调控细胞骨架功能从而控制吞噬作用发生的过程中起着重要的作用。基于上述的研究结果,我们进一步检测了paxillin在Ser83位点的磷酸化蛋白水平。在LPS（100ng/m L）作用下,用10μM MA或5μM塞来昔布处理BV2细胞6h,通过蛋白免疫印迹法检测paxillin Ser83的激活水平（图6A）。实验结果显示,MA和塞来昔布均能显著抑制LPS诱导的P-paxillin Ser83水平的升高。此外,我们还借用荧光磁珠,通过免疫荧光实验进一步观察和量化在LPS诱导激活的原代小胶质细胞中,MA和塞来昔布对细胞吞噬功能活性的影响。在LPS（100ng/m L）的作用下,用10μM MA或5μM塞来昔布对静息状态下的原代小胶质细胞处理6h,然后用共聚焦显微镜检查荧光磁珠的吞噬数量（图6B）。原代小胶质细胞经LPS处理后吞噬活性显著增强,而经MA和塞来昔布处理的细胞则减弱了LPS诱导吞噬活性的增强。这一结果与MA和塞来昔布均能显著抑制LPS诱导的P-paxillin Ser83水平的升高结果一致,表明MA和塞来昔布对LPS炎性诱导的小胶质细胞激活具有显著抑制作用,并进一步证明MA具有改善慢性应激导致的神经炎症的作用和在抑郁症中发挥神经保护的作用。综上,在本研究中我们发现,MA的治疗可有效改善由不可预知慢性应激诱发的小鼠抑郁样行为,并通过抑制ERK1/2、p38 MAPK的激活和降低i NOS的表达来减轻激活的BV2小胶质细胞的炎性程度。此外,我们推断MA在抑郁症中的神经保护作用是通过减少海马DG区活化和吞噬性小胶质细胞（CD68+）数量而产生的。从而进一步证实,MA通过抑制COX活性而发挥的神经保护作用与另一种COX-2抑制剂塞来昔布的作用方式是相同的。