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背景:缺血性心脏病（Ischemic heart disease,IHD）不仅是老年人易患病,发病人群已有年轻化趋势,因其发病时可危及生命,而普遍得到关注。心肌缺血可诱发心肌细胞（Cardiac myocytes,CMs）坏死,CMs作为终末分化细胞,几乎不能再生,因此CMs坏死后,纤维组织逐渐代替坏死组织,心脏就会产生不可逆损伤,随着心功能减退直至心力衰竭。目前,医院对待IHD的治疗普遍采取药物缓解、介入或者是心脏移植。近来研究表明:将骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）移植至心肌梗塞的心脏,心脏功能会随之而改善,并能提高患者的生活质量,这使再生医学治疗IHD得以实现。间充质干细胞可以通过骨髓、羊水、脂肪等组织获得,BMSCs具有获取相对较易,具多向分化潜能、自体移植无免疫排斥、不涉及道德伦理问题等优点,使它被广泛用于再生医学。BMSCs的多向分化潜能体现在可以分化为神经细胞、骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、肝细胞等外胚层及中胚层的细胞,这些特性使BMSCs在再生医学中具有巨大临床应用潜能。丁酸钠属于组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor,HDACi）中的短链脂肪酸,它的受体是G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors,GPCRs）中的GPCR43和GPCR41,丁酸钠可以降低HDAC1的表达,使组蛋白乙酰化,促进BMSCs向CMs分化,但丁酸钠有明显的细胞抑制作用。成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor,FGF-2）作为人体组织内普遍存在的生长因子,具有明显的促进增殖和分化作用。近来研究表明:第一,丁酸钠可以抑制HDAC促进FGF启动子的激活;第二,与FGF-2单独诱导相比,FGF-2和5-氮胞苷联合诱导BMSCs向心肌细胞分化的效率高,5-氮胞苷和丁酸钠虽都属于表观遗传学,但是丁酸钠比5-氮胞苷的诱导分化率高;第三,GPCR和受体酪氨酸激酶的各种成员可以一起形成异源复合物,并触发不同的细胞内信号传导和细胞应答;第四,丁酸钠抑制细胞增殖,FGF-2促进细胞增殖。目的:本实验应用丁酸钠和FGF-2联合诱导与它们分别单独诱导相比,根据心肌特异性基因和蛋白的表达,了解二者是否有协同作用,探讨它们如何促进BMSCs向CMs分化,为治疗心脏病的细胞移植提供基础依据。方法:选择2～3周龄SD大鼠四肢骨髓,经过全骨髓贴壁法分离纯化BMSCs,待细胞第1代融合到90%的时候,一部分细胞冻存,剩下的一部分细胞继续培养,选取长势良好的第3代细胞,进行流式细胞技术鉴定,接着复苏冻存的细胞进行诱导培养,取长势良好的第3代细胞进行实验,分为4组:阴性对照组、丁酸钠组、FGF-2组、丁酸钠协同FGF-2组（联合组）,MTT检测细胞的增殖率,分别提取4组细胞1、2、4周的总RNA,通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测心脏转录因子,对诱导培养4周的细胞进行免疫细胞化学和蛋白免疫印迹（Western blotting,WB）实验,检测BMSCs诱导4周后心脏特异性蛋白的表达。结果:通过倒置显微镜下察看BMSCs形态变化:原代细胞收集到细胞培养瓶中,镜下观察呈圆形、悬浮状态,48h呈圆扁形、开始贴壁生长,72 h后观察,大部分细胞呈现梭形,培养1周的BMSCs细胞进一步伸展,出现梭形、多角形和不规则形等多种形态,诱导培养4周后的BMSCs,相邻细胞间具有明显的方向性排列,一些细胞甚至成了漩涡样结构。流式细胞仪进行BMSCs鉴定:最后测得表面抗原CD29、CD45、CD90的阳性表达率分别为93.1%、1.7%、95%,结果证明分离的细胞为纯化的BMSCs。MTT检测:在促进细胞增殖方面,丁酸钠有抑制作用,FGF-2可以促进细胞增殖,联合组的促进增殖效果低于FGF-2组,但高于丁酸钠组,差异具有统计学意义（P<0.05）。RT-qPCR检测结果:GATA-4基因在诱导2周后,各诱导组明显增高,联合组基因表达最强;MEF-2c基因在诱导4周后,各诱导组都出现上升趋势,联合诱导组基因的表达量最多,差异具有统计学意义（P<0.05）。WB检测结果:BMSCs诱导4周后心脏特异性蛋白缝隙连接蛋白43（Connexin 43,CX43）、Desmin和心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）的阳性表达,选择β-actin作为内参蛋白,联合组明显高于其他诱导组,而未诱导组细胞的蛋白表达量低于诱导组细胞,差异具有统计学意义（P<0.05）。运用免疫细胞化学检测:BMSCs经诱导培养4周后的心脏特异性蛋白心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T,c Tn T）、cTnI和Desmin的阳性表达,联合组明显高于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。实验结果表明:1.经全骨髓贴壁法结合密度梯度离心法,分离得到的骨髓细胞可以纯化为BMSCs。2.丁酸钠和FGF-2可以单独和协同诱导BMSCs向心肌样细胞分化,采用丁酸钠协同FGF-2联合进行诱导,效果更佳。