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(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇((R)-CCE)是一种重要的手性中间体,主要合成多种β3-肾上腺素能受体激动剂,如抗肥胖和抑郁药物SR 58611A、TAK 677、CL 316243等。近年来利用生物催化不对称还原间-氯苯甲酰甲基氯(m-CPC)制备(R)-CCE己成为研究的热点。由于在不对称还原反应中需要辅酶的参与,昂贵的辅酶是限制其工业化应用的关键因素。为了解决辅酶再生的问题,本文利用基因工程的方法,实现了在E.coli中共表达羰基还原酶(Sy S1)和葡萄糖脱氢酶(Sy GDH),并以此重组菌为催化剂不对称还原m-CPC制备(R)-CCE进行了研究。首先根据E.coli密码子的偏好性,人工合成了密码子优化后的木兰假丝酵母(Candida magnoliae)的Sy S1基因Sys1和嗜酸热源体(Thermoplasma acidophilum)的Sy GDH基因Sygdh序列。构建表达载体p ET-22b-Sys1和p ET-28a-Sygdh分别导入E.coli BL21(DE3)中,获得E.coli BL21/p ET-22b-Sys1和E.coli BL21/p ET-28a-Sygdh重组菌,经IPTG诱导,Ni柱纯化后,SDS-PAGE分析显示在表观分子量为30.0 k Da和41.0 k Da处有单一的条带。酶学性质和动力学参数研究表明,Sy S1和Sy GDH的最适p H为7.0和7.5,分别在p H 5.5-7.5和p H 4.5-8范围内较稳定;最适作用温度都为40℃,并分别在40℃和65℃以下保持稳定;除Zn2+对Sy GDH有一定促进作用,其它所测定的金属离子及EDTA对Sy S1和Sy GDH的酶活影响不大;所测助溶剂对Sy GDH的酶活影响不大,DMSO和DMF对Sy S1的影响较小;Sy S1对底物m-CPC的Km和Vmax分别为6.5mmol/L和0.32 U/mg,Sy GDH对底物葡萄糖的Km和Vmax分别为28.2 mmol/L和6.5 U/mg。其次为解决辅酶再生的问题,采取了两种共表达Sy S1和Sy GDH的策略。成功构建了单质粒共表达系统E.coli BL21/p ETDuet-Sygdh-Sys1和双质粒共表达系统E.coli BL21/p ET-22b-Sys1/p ET-28a-Sygdh。通过对二者的表达条件进行优化,结果表明E.coli BL21/p ETDuet-Sygdh-Sys1在最佳诱导条件IPTG 0.6 mmol/L、温度28℃、时间12 h时,Sy S1和Sy GDH的酶活分别为3.73 U/g和44.1 U/g;E.coli BL21/p ET-22b-Sys1/p ET-28a-Sygdh在最佳诱导条件IPTG 0.8 mmol/L、温度26℃、时间10 h时,Sy S1和Sy GDH的酶活分别为2.85 U/g和56.3 U/g;权衡反应中的关键酶是Sy S1,最终选择E.coli BL21/p ETDuet-Sygdh-Sys1作为生物催化剂。最后对重组菌E.coli BL21/p ETDuet-Sygdh-Sys1全细胞催化m-CPC的反应条件进行了优化,结果表明在助溶剂DMSO浓度15%(v/v),底物浓度30 mmol/L,湿菌体浓度70 mg/m L,反应p H 7.0,反应温度40℃,葡萄糖浓度40 mmol/L,辅酶NADP+浓度0.2mmol/L,反应时间条件3 h下,得到产物(R)-CCE的摩尔产率和e.e.值分别达到99.2%和>99%。