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目的: 利用微生物遗传学和分子生物学等分析手段，探究E.coli iscA/sufA双突变恢复体revertant生长恢复的原因和分子机制，为进一步阐明IscA和SufA在铁硫簇生物合成过程中的作用和铁离子的具体代谢通路提供依据。 利用分子克隆和蛋白亲和层析技术，从E.coli未知功能的蛋白中筛选铁硫蛋白，为铁硫簇的特性和功能研究提供基础知识，为治疗人类铁硫簇异常所导致的相关疾病奠定基础。 方法: 1.从iscA/sufA双突变中获取恢复体Revertant 对本实验室构建好的iscA/sufA双敲除菌A-SA--1的纯度和完整性进行鉴定时发现基因组上还缺失了ynaJ，uspE，fnr三个基因，为保证后续实验结果的准确性和可靠性，利用Red系统重新构建iscA/sufA双突变菌A-SA-并对其基因组完整性进行验证。基因敲除主要由氯霉素抗性基因的扩增，重组质粒的转化，筛选氯霉素抗性转化体和氯霉素抗性基因的去除四部分构成。在做平板划线和转化实验时，得到了一株和MC4100菌落大小相似的iscA/sufA双突变菌株，即revertant。 2.Revertant和A-SA-生长表型的研究 将revertant和A-SA-起始浓度调一致，分别在LB培养基和M9培养基中培养并监测600 nm处的O.D值，做出生长曲线图，比较revertant和A-SA-生长速率的差异，确定reverant生长有所恢复。 3.Revertant生长恢复原因的探究 3.1铁硫簇组装对Revertant生长恢复的影响 将能够表达[2Fe-2S] Fdx，FhuF和[4Fe-4S] Nth，IlvD的表达质粒分别转入MC4100，revertant和A-SA-中诱导表达，并用镍柱亲和层析技术获取高纯度的蛋白，全波长扫描对其进行光谱学分析，研究铁硫簇组装和生长恢复的关系。 3.2探究铁离子与Revertant生长恢复的关系。 用Trizol法提取MC4100，revertant，A-SA-中总RNA，逆转录出cDNA，采用qPCR研究铁代谢相关基因fecA和fur在revertant，A-SA-中转录量是否有差异。进一步通过转录组测序，分析铁离子对生长恢复的影响。 3.3 fec操纵子敲除后Revertant及A-SA-生长表型的变化。 Fec操纵子负责大肠杆菌中铁的转运。用带有FRT位点的氯霉素抗性基因替换fec操纵子基因，经过多次纯化获取不含有fec操纵子的fec∷cat/revertant及fec∷cat/A-SA-，做生长曲线和平板实验，研究fec操纵子对revertant和A-SA-的影响。 3.4研究基因组突变与Revertant生长恢复的关系。 分别在37℃，250 rpm条件下培养MC4100，revertant和A-SA-，在OD600=0.6时收获菌体，提取基因组DNA送杭州联川生物技术有限公司进行基因组测序。据测序结果推测revertant生长恢复的靶基因。 4.从未知功能蛋白中筛选铁硫蛋白 从EcoGene数据库中筛选出目的基因20个，利用基因工程技术构建表达载体。对目的蛋白做光谱学分析，铁硫含量测定及纯度鉴定并分析它们是否为铁硫蛋白。 结果: 1.恢复体Revertant是iscA/sufA双突变菌株。 对挑选到的revertant进行PCR鉴定，确定其是iscA基因和sufA基因同时缺失的菌株。 2.Revertant在LB中生长恢复到野生型MC4100的90％，在M9中生长缓慢。 3.在Revertant中[4Fe-4S]的组装有部分恢复。 Revertant和A-SA-中的[2Fe-2S] Fdx在415nm和459 nm处有特征性的吸收峰，FhuF在450 nm处有铁硫簇的吸收峰;表明在A-SA-和revertant中[2Fe-2S]的合成可以顺利进行。[4Fe-4S] Nth和IlvD蛋白在A-SA-中无419nm，415nm处特征性吸收峰。而revertant中419nm和415nm处的吸收峰有恢复，[4Fe-4S]簇可以合成。 4.在转录水平，fecA和fur在A-SA-和Revertant中转录量有差异。与野生型MC4100比较，fecA在A-SA-中上调，在revertant中fecA的转录量几乎恢复到平衡状态。fur在A-SA-中明显下调，而在revertant中转录量介于MC4100和A-SA-之间。 将fec操纵子敲除后，A-SA-可在M9基础培养基上缓慢生长。这一结果间接说明revertant生长的恢复与细菌内的铁离子浓度有关。 5.筛选到2个铁结合蛋白和3个铁硫蛋白。 对克隆好的20种蛋白进行纯化，筛选到RspB和YbeL两个铁结合蛋白，YgiQ，YidF和YeaW三个铁硫蛋白。RspB在520 nm处有特异性吸收峰且单位蛋白约含有0.3个铁原子，YbeL在380 nm，485 nm，560 nm处有特异性吸收峰;YgiQ呈浅褐色，在420nm处有特异性吸收峰且Fe/S≈1;铁硫蛋白YidF在320 nm和420 nm处各有一个特异性吸收峰，Fe/S≈1;铁硫蛋白YeaW在315nm，420 nm附近有特异性的吸收峰，Fe/S≈1。 结论: 本文从基因水平，转录水平和铁硫簇组装情况三个方面探究revertant生长恢复的原因，初步得到以下结论:Revertant和A-SA-基因组序列无差异，其生长恢复不是由于基因组变异引起的。与A-SA-比较，revertant中[4Fe-4S]的组装恢复，可能导致其生长恢复。Revertant和A-SA-中铁代谢相关基因fecA和fur在转录水平上的差异以及敲除fec操纵子的A-SA-的生长恢复实验说明revertant的生长恢复与铁离子代谢相关。即A-SA-中由于IscA/SufA的缺失，[4Fe-4S]铁硫簇的组装受抑，Fur蛋白失去活性，细胞从外界转运大量的铁离子，铁离子的积累对细菌造成毒性，其生长被抑制。Revertant中的[4Fe-4S]铁硫簇恢复组装且铁离子受到调控而生长部分恢复。 我们筛选得到了铁结合蛋白2种:YbeL和RspB，铁硫蛋白三种:YgiQ，YidF和YeaW。