研究背景：乳腺癌是一种严重威胁女性健康的恶性肿瘤，占女性全部恶性肿瘤的18%，已经成为35-65岁妇女第一位死亡原因。尽管个体化的靶向治疗和其他治疗手段的快速发展显著地延长了乳腺癌的生存期，但是我们仍然对乳腺癌治疗中靶向治疗耐药及三阴性乳腺癌无有效治疗药物等问题束手无策。这主要是由于乳腺癌本身具有高度异质性，发病因子、疾病演进、治疗反应和器官转移倾向等互异。要想彻底地战胜乳腺癌，需要更深入地研究乳腺癌发生、发展相关的信号通路，寻找新的个体化治疗靶点。鉴于PI3K/AKT/mTOR通路的上游成员例如ER、PR和HER2在乳腺癌的重要地位，同为上游成员的胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor1receptor，IGF-1R）引起研究者们的极大兴趣。IGF-1R是一种异四倍体的细胞质膜糖蛋白，为一种跨膜的酪氨酸蛋白受体。在结合胰岛素样生长因子配体后，通过自身磷酸化，激活PI3K以及MAPK信号通路，调控细胞的增殖、分化和衰老。该通路在乳腺癌中的高频率失调,并证实其介导的信号在乳腺癌的生长、演变、侵袭以及肿瘤血管生成、转移中均扮演着重要的角色。作为肿瘤靶向治疗最有前景的靶点之一，针对IGF-1R的靶向治疗药物也逐渐问世。早期的试验结果非常令人鼓舞，遗憾的是随后进行的试验中有很多结果是失败的，这说明我们对信号通路的认识并不充分,使得我们有必要更深层次地探讨其调控机制，并进一步寻找能够预测抗IGF-1R治疗效果的生物标志物，进而选择潜在获益的正确的目标人群。新近研究发现，曾经被认为是基因转录“副产品”或“暗物质”的长链非编码RNA（long non-codingRNA,LncRNA）能够通过多种作用方式调控肿瘤细胞的基因表达，从而广泛参与肿瘤的发生及转移。LncRNA是指一类长度超过200个核苷酸的RNA分子的总称，已经成为当今分子生物学最热门的前沿研究领域之一。虽然在人类基因组中已经发现了一些LncRNA，但关于其对基因组的调控及具体机制尚不清楚，国际上亦没有任何关于LncRNA调控IGF-1R表达的报道。本课题客座导师胡继繁教授前期采用他在《Science》上发表的研究染色质空间结构方法，寻找参与IGF-1R启动子区域的调控因子时在IGF-1R基因区发现一条全新的lnRNA，命名为IRAIN。依据IGF-1R通路在乳腺癌中的重要地位及IRAIN处于IGF-1R基因区这一事实，我们推测IRAIN在乳腺癌的发生、发展中扮演一定的角色，然而IRAIN在乳腺癌领域的研究仍处于完全空白状态。研究目的：阐明一种全新的长链非编码RNA IRAIN在正常乳腺组织及各分子亚型乳腺癌组织的的表达水平、表达特点及其与IGF-1R基因表达的相关性；进一步明确调控IGF-1R信号通路的关键分子及其作用机制；揭示IRAIN与乳腺癌临床病理因素和预后的相关性。为乳腺癌寻找有预测、预后价值的生物标记物及个体化的乳腺癌治疗靶点提供全新的思路和实验依据。研究方法：1.半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）确定IRAIN mRNA是否表达于乳腺癌组织中。2.应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测IRAIN mRNA和IGF-1R mRNA在正常乳腺组织及不同分子亚型乳腺癌组织的表达水平、表达特点。3.应用链方向特异性RT-PCR（Strand-Specific RT-PCR,SSRT-PCR）绘制IRAIN转录方向。4.用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性分析法(PCR-RELP)及DNA测序方法分析乳腺细胞系及冰冻人乳腺癌组织中IRAIN SNP位点（rs8034564）杂合状态及等位基因表达特点，明确该基因是否呈单等位印记表达。5. DNA测序方法追踪印记亲本来源，分析正常组织与乳腺癌组织以及乳腺癌原发部位与转移部位印记的变化情况。6.结合重亚硫酸盐的测序法（Bisulfite Genomic Sequence，BSP）分析IRAIN启动子DNA甲基化状态，初探单等位印记表达及发生印记转换的机制。7.统计学分析IRAIN mRNA和IGF-1R mRNA表达与乳腺癌临床病理特征及预后之间的关系。研究结果：1．半定量分析表明IRAIN在乳腺癌中广泛表达，表达水平各异。进一步应用实时荧光定量PCR方法对各分子分型乳腺癌及正常乳腺组织中IRAIN mRNA表达进行定量分析，实验结果显示，与正常乳腺组织相比,各分子亚型乳腺癌中IRAIN表达均降低,其中以三阴性乳腺癌降低最为明显，HER2阳性型乳腺癌IRAIN表达也明显低于正常乳腺组织，两者差异均有统计学意义（P＜0.05）。Luminal型同样低于正常乳腺组织，但无统计学意义。而对后三者做两两比较，无统计学意义（P＞0.05）。IGF-1R在预后最好的Luminal型中表达最高，与正常乳腺组织接近，而在预后差的TNB型和HER2+型表达明显低于正常乳腺组织及Luminal型，差异有统计学意义（P＜0.05）。对TNB型和HER2+型两者做比较，无统计学意义（P＞0.05）。2.选取IRAIN基因上两个不同位置，在多个乳腺癌患者组织上应用SSRT-PCR方法确定IRAIN转录方向，其结果均是一致的，IRAIN转录方向与IGF-1R mRNA的方向相反，阐明IRAIN为IGF-1R的反义长链非编码RNA。3．IRAIN在人正常乳腺组织中呈单等位基因表达，在乳腺癌组织中仍呈单等位基因表达。有趣的是，单等位基因呈不均衡表达，等位基因‘A’优势表达，18例SNP位点为杂合子的患者中，16例表达等位基因“A”，占89%，只有2例表达等位基因“G”占11%，目前还不清楚等位基因“A”的优势表达是否与这种非编码RNA的功能相关。4．为了确定IRAIN亲本来源即是父源等位基因表达还是母源等位基因表达，我们进行了家系追踪筛查，结果表明IRAIN是父源等位基因表达、母源印记的基因。5．首次发现乳腺癌组织中发生了异常的IRAIN等位基因印记转换（allele-switch）现象，即同一患者的正常组织与乳腺癌组织IRAIN呈现不同父母来源的单等位基因表达，也见到乳腺癌原发部位与转移部位印记转换现象。6．BSP方法分析富含CpG岛的IRAIN基因启动子区DNA甲基化状态，发现乳腺癌中IRAIN启动子区域甲基化异常，提示DNA甲基化可能参与调控IRAIN基因单等位印记表达及发生印记转换。7．IRAIN在正常乳腺组织中表达最高，在恶性程度高的三阴性乳腺癌及HER2阳性型乳腺癌显著低表达，提示IRAIN可能作为抑癌基因，调控肿瘤细胞生长。IRAIN表达高低与患者月经状态、肿瘤直径、淋巴结转移情况、组织学分级、脉管癌栓及增殖指数无显著相关性。研究结论：1．本研究发现全新的位于IGF-1R基因区的长链非编码RNA IRAIN在乳腺癌中广泛表达，IRAIN在正常乳腺组织中表达最高，在恶性程度高的三阴性乳腺癌及HER2阳性型乳腺癌显著低表达，提示IRAIN可能作为抑癌基因，调控肿瘤细胞生长。2．IRAIN转录方向与IGF-1R mRNA的方向相反，是IGF-1R基因的反义长链非编码RNA。3．IRAIN在人正常乳腺组织及乳腺癌组织中呈单等位基因表达，单等位基因呈不均衡表达，优势表达其中一条等位基因。是父源等位基因表达、母源印记的基因，与其启动子区DNA甲基化异常有关，是人类基因组为数不多印记基因中新发现的成员之一。4．首次发现乳腺癌中存在IRAIN等位基因印记转换（allele-switch）现象，这在乳腺癌和其他恶性肿瘤中国内外均未见报道，如果像我们推测的IRAIN作为抑癌基因，那么印记转换很可能是抑癌基因失活的一种全新的方式，正如印记丢失(LOI)在肿瘤中的地位一样，是一种标志性的事件。5．IRAIN有望成为对乳腺癌有预测、预后价值的生物标记物及个体化的乳腺癌治疗靶点。6．IRAIN的研究得到了权威机构的认可，在2014年末IRAIN被世界最权威的美国国立生物信息中心基因库（gene bank）验证通过，将它收录入库，Gene ID:104472848。