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microRNA简称miRNA,是一种21-25个碱基的非编码小分子RNA,它广泛存在于真核生物中。miRNA基因的初级转录产物(pri-miRNA)在细胞核中被RNaseⅢDrosha切割成为前体miRNA(pre-miRNA),pre-miRNA在转运蛋白exportin-5的作用下由核内转到胞质中,然后由另一种RNaseⅢDicer进一步切割产生成熟的miRNA。这些成熟的miRNA与其他蛋白质一起组成RISC(RNA-induced silencing complex)复合体,从而引起靶mRNA的降解或者翻译抑制。miRNA广泛存在于动物、植物以及病毒中,第一个被确认的是在线虫中首次发现的lin-4和let-7,随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。截止2008年9月,登载在Sanger miRNA数据miRBase12.0 (http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)中的miRNA总数已达8273种。大量研究表明,miRNA参与了包括细胞分裂增殖、分化与发育以及代谢等许多重要的生物学过程。哺乳动物的免疫系统在抵抗感染、自身稳定和免疫监视方面发挥重要作用。为达到免疫应答和免疫耐受的恰当平衡,免疫反应的起始、终止和反应强度必须被严谨调节。相对于转录因子全开或全关的调节方式,miRNAs更适合对免疫系统进行精细调节和定量调节,因为它们通过非常短的作用位点进行调节,在作用位点一个或少数几个碱基对就能起到关键作用,并且由于它们在进化过程中易于突变,从而为生物体提供了随病原进化同时发挥作用的基因调节子储存库。最近研究表明miRNAs确实在免疫系统的精细调节中发挥重要作用。深入理解miRNA调节免疫系统的机制,不仅有助于鉴定调节免疫反应的新靶标,而且有助于建立有效的miRNA新疗法。在本实验中,为了探询T细胞活化是否对miRNA的表达谱产生影响,我们应用Exiqon miRNA基因表达谱芯片,以活化的Jurkat细胞(用CD3抗体和CD28抗体双信号活化)为实验组,未活化Jurkat细胞为对照组,分析了二者miRNA表达谱的差异,找出表达水平显著改变(下调超过2倍)的miRNA。芯片结果显示,与未活化的Jurkat细胞相比,活化的Jurkat细胞中有一些miRNA表达水平明显下调。我们对部分下调的miRNA进行了实时定量PCR检测来验证芯片的结果。为了进一步确实miRNA和人T淋巴细胞活化的关系,我们通过miRanda来预测miRNA在T细胞活化过程中的潜在作用位点,并在此基础之上进行验证。预测结果表明:miR-33b和miR-568对T细胞活化过程中的许多重要分子都有作用位点,这些分子包括CD96、CD28、NF1、CD3G、IL2RA、IL2RB、NFAT5、CD8B、RAC3等。其中,miR-568的靶分子NFAT5在预测的靶分子的评分中,分数最高,并且miR-568和NFAT5有4个潜在作用的位点,说明NFAT5很有可能是miR-568针对的一个靶分子。为了验证这些预测的靶分子是否为miRNA真正作用的靶标,我们将预测的靶分子的3′UTR序列中miRNA结合位点上下游的部分片段导入pGL3-MCS2荧光素酶表达载体中,构建双荧光素酶报告系统,然后分别将miRNA真核表达质粒或合成的miRNA以及对照pcDNA3或合成的阴性对照scramble miRNA(N.C.)与构建好的靶分子真核表达载体、质粒pRL-TK共转染HEK293细胞,观察荧光素酶活性的变化。结果显示:miR-568对NFAT5有比较明显的抑制作用,提示miR-568可能通过NFAT5对T细胞活化起到一定的作用。