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SOS(Salt-Overly-Sensitive)途径是植物调控Na+运输的重要途径,SOS途径主要涉及三个功能蛋白,即质膜Na+/H+逆转运蛋白SOS1、蛋白激酶SOS2和Ca2+结合蛋白SOS3。SOS1是一个重要的植物盐胁迫决定因子,在盐胁迫时能够把植物细胞内多余的Na+排出体外。SOS 1在正常情况下维持休眠状态,其活性受SOS2/SOS3蛋白激酶复合体调控。本研究通过同源克隆的方法克隆了小麦TaSOS2、TaSOS3基因,并且借助酵母突变菌株AXT3K,拟南芥突变体sos1,酵母双杂交系统等技术体系,研究了 TaSOS2、TaSOS2/TaSOS3复合体对TaSOS1的调控,并对TaSOS1的活性调控区进行了分析,从中筛选出高活性突变基因,对小麦SOS途径的作用机理进行了阐述。主要研究结果如下:1.克隆了六倍体普通小麦SOS途径中重要的调控蛋白基因TaSOS2、TaSOS3,同源性比对表明TaSOS2与拟南芥AtSOS2蛋白序列的同源性是68.08%,与水稻OsCIPK24(OsSOS2)的同源性是86.83%。TaSOS3与拟南芥AtSOS3蛋白序列的同源性是60.81%,与水稻OsCBL4(OsSOS3)的同源性是81.65%,说明我们克隆得到的基因可能为SOS途径相关基因TaSOS2、TaSOS3。2.把TaSOS2和TaSOS3与TaSOS1同时转化酵母盐敏感突变体菌株AXT3K,用加合适浓度NaCl的AP培养基鉴定转基因酵母的耐盐表型,以检测TaSOS3和TaSOS2对TaSOS1的调控作用。酵母突变体AXT3K缺失内源的耐盐基因,在添加40 mMNaCl的AP培养基上生长受到抑制,转TaSOS1的酵母细胞耐盐达到80 mMNaCl;同时转化TaSOS2和TaSOS1的酵母细胞可以在含有400 mM NaCl的AP培养基上生长,TaSOS3/TaSOS2和TaSOS1共表达也能在400 mMNaCl条件下生长。用原子吸收分光光度计测量转基因酵母干细胞内Na+和K+含量,转TaSOS2/TaSOS1的酵母细胞比只转了TaSOS 的酵母细胞Na+含量降低,K+含量升高。TaSOS3/TaSOS2复合体和单个的TaSOS2都能调控TaSOS1的活性,而与此不同,在拟南芥中单独的SOS2不能激活SOS1的活性。3.生物信息学分析表明TaSOS1基因编码一个含有1142个氨基酸残基的多肽,它的疏水性N-端含有12个跨膜结构域,分布在细胞质中的亲水性C-端较长,约713个氨基酸残基。为确定TaSOS2和TaSOS1相互作用的结合位点,本实验从C-末端开始每隔20个氨基酸残基截取TaSOS1的C-末端,获得TaSOS1的缺失突变基因,分别为Δ1122、Δ1102、Δ1082、Δ1062、Δ1042、Δ1022、Δ1002。把这些突变体和TaSOS2或者TaSOS2/TaSOS3共同转化酵母突变体鉴定其表型。结果表明TaSOS2不能调控Δ1122和Δ1122之前氨基酸片段的活性,但是TaSOS2/TaSOS3复合体可以调控Δ1122的活性,这个结果说明TaSOS2和TaSOS1的结合位点在1122残基之后,但TaSOS2/TaSOS3复合体的结合位点在1122残基之前,TaSOS2和TaSOS2/TaSOS3复合体对TaSOS1的调控位点不同。为确定TaSOS2对TaSOS1的结合位点,又增加了 TaSOS1的缺失突变Δ1132,酵母互补试验结果表明:TaSOS2对Δ1132的调控表型和其对TaSOS1野生型的调控表型相同。因此TaSOS2和TaSOS1的结合位点在1122-1132这10个氨基酸残基中,可能是1126 S和1128 S两个丝氨酸位点。实验中通过点突变将1126S突变成丙氨酸1126A、1128S突变成天冬氨酸1128D,经过酵母互补试验证明点突变的突变体不受TaSOS2调控,以上结果推测TaSOS2与TaSOS1的结合位点是1126S和1128S。4.构建TaSOS1和Δ1122的植物表达载体并转化拟南芥突变体sos1,结果表明,转Δ1122突变基因的拟南芥表型和野生型基因的表型相同,表明Δ1122可以和sos1突变体内源的SOS2/SOS3复合体互作,增强植株的耐盐性,从而验证TaSOS2/TaSOS3复合体与TaSOS1的结合位点在氨基酸残基1122之前,与单个TaSOS2的结合位点不同。5.为了鉴定TaSOS1自我抑制区域,从中筛选出高活性的TaSOS1突变基因,构建TaSOS1 C-末端部分缺失突变基因Δ428、Δ532、Δ697、Δ727、Δ974。对这些突变体采用PEG转化法分别转化酵母AXT3K菌株,进行了酵母互补试验,结果表明:在这些突变体中,缺失全部C-末端的Δ428和缺失C-末端较多的Δ532、Δ697丧失了 TaSOS1的耐盐功能,而Δ727以后的突变基因耐盐功能比野生型要好,突变基因Δ974耐盐功能最强,与野生型相比功能提高10倍,可以在1 M NaCl的培养基上生长,Δ982的耐盐功能又下降到200 mM NaCl,Δ1022-1062耐盐功能基本相同,都可以在400 mMNaCl的AP培养基上生长,以后开始下降,Δ1062-Δ1132只可以在100 mMNaCl的AP培养基上生长,恢复到野生型的耐盐表型。从这些突变基因中筛迁出耐盐功能没有受到抑制的Δ974突变基因,即超活性突变基因。6.把超活性突变基因Δ974转化拟南芥,结果表明Δ974在拟南芥中具有高耐盐活性,通过测定转基因拟南芥根尖的Na+转运活性表明,Δ974对Na+的外排速度比野生型强。结果说明我们得到了高耐盐的小麦突变基因,对小麦耐盐基因工程有重要意义。