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牛呼吸系统疾病（Bovine respiratory diseases,BRD）是肉牛养殖业中最常见的疾病之一,其主要病原菌已对临床常用药物产生较严重的耐药性,据统计每年因抗感染失败造成约8亿至9亿美元的经济损失,为此针对BRD主要病原菌开展新型抗菌药物研发已刻不容缓。细菌素被认为是临床和兽医治疗中抗生素的潜在替代品之一,细菌素是由细菌和古生菌核糖体合成的小分子多肽或蛋白质,它们对某些临床致病菌和部分耐药细菌具有较好抗菌活性。本研究从长白山土壤中分离到1株对牛源及其他动物源性多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,P.multocida）具有较好抗菌活性的菌株Pseudomonas sp.166,对其抗菌物质进行分离纯化,并对纯化后的抗菌蛋白的稳定性、安全性及杀菌机制进行了评估,为抗BRD新型抗菌药物的研发奠定了基础。主要研究结果如下:1.牛源多杀性巴氏杆菌拮抗菌的筛选及鉴定在吉林省6个不同地区采集432份土壤样品,从中分离出856株菌株,以牛源P.multocida作为指示菌,分离得到52株具有拮抗活性的菌株。其中分离自长白山土壤编号为166的菌株抗菌活性最好,抑菌直径可达35 mm。经16S r DNA鉴定菌株166为Pseudomonas sp.166,其发酵产物不但对BRD主要病原菌（P.multocida、溶血性曼氏杆菌）有较好的抗菌活性,对MRSA与屎肠球菌也有一定程度的抗菌活性。对Pseudomonas sp.166生长情况及抗菌活性进行60小时的测定,结果显示在培养20 h后Pseudomonas sp.166进入对数生长期,在培养28 h后开始产生抗菌蛋白,在48 h后抗菌蛋白活性达到了3200 AU/m L。2.抗菌蛋白PA166的分离鉴定及理化特性分析采用硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶层析柱与QAE-sephdex纯化柱对Pseudomonas sp.166发酵产物进行逐级分离纯化,并将纯化后的抗菌蛋白命名为PA166。经SDS-PAGE及LC-MS/MS对抗菌蛋白PA166进行鉴定,其分子量大小为49.380 k Da。对抗菌蛋白PA166分子组成及理化参数进行预测,其分子式为C2255H3441N617O750S12,氨基酸数量为479个,理论等电点是4.47,且为亲水性蛋白。理化特性分析显示抗菌蛋白PA166具有较好的温度稳定性和酸碱稳定性,在Ga2+、Mg2+和K+、β-巯基乙醇、EDTA、二硫苏糖醇、聚乙二醇辛基苯基醚、吐温20及吐温80的作用下,抗菌蛋白PA166对P.multocida的抑菌活性较为稳定,但在蛋白酶K的作用下其抗菌活性完全消失。3.抗菌蛋白PA166体外抗菌活性和安全性初步评价体外抗菌活性测定结果表明抗菌蛋白PA166对耐喹诺酮类,四环素类,大环内酯类及氨基糖苷类P.multocida的MIC分别为1μg/m L、2μg/m L、1μg/m L及1μg/m L,最低杀菌浓度（Minimum bactericidal concentration,MBC）分别为4μg/m L、4μg/m L、2μg/m L及2μg/m L。对PA166的安全性进行初步评价,结果显示在浓度为256μg/m L时溶血率仅为1.36%,细胞的的存活率也在80%以上。抗菌蛋白PA166浓度为MIC和MBC时均未引起斑马鱼的胚胎毒性。连续7天,每天3次腹腔给予小鼠4 mg/kg和16 mg/kg抗菌蛋白PA166,通过血常规指标检测及血液生化指标检测表明小鼠的机体的各项生理指标均正常。采用16 mg/kg抗菌蛋白PA166治疗感染P.multocida的大蜡螟及小鼠,治疗后大蜡螟及小鼠的存活率均可达到100%。4.抗菌蛋白PA166杀菌机制的初步研究通过对DNA凝胶阻滞、内膜通透性、外膜通透性及膜电位变化的测定分析抗菌蛋白PA166的抗菌机制。抗菌蛋白PA166浓度为0.5～256μg/m L未能与P.multocida ATCC43137的DNA结合,也未引起P.multocida ATCC43137内膜通透性的改变。4μg/m L抗菌蛋白PA166可诱导P.multocida ATCC43137外膜通透率增加50%,8μg/m L抗菌蛋白PA166引起细胞外膜的通透率高于10μg/m L多黏菌素B所引起细胞外膜的通透率,膜电位的变化随抗菌蛋白PA166浓度的增加而升高。抗菌蛋白PA166作用于P.multocida ATCC43137后,细胞内的ROS的含量显著量增加,ATP的含量明显降低。根据扫描电镜和透射电镜观察到抗菌蛋白PA166可破坏P.multocida ATCC43137的细胞膜。分子对接结果表明抗菌蛋白PA166可以与细胞外膜蛋白Bam A结合。荧光定量结果表明抗菌蛋白PA166作用P.multocida ATCC43137后,P.multocida ATCC43137的bam A基因表达量显著降低。竞争结合试验结果显示加入Bam A蛋白,抗菌蛋白PA166的活性显著降低,从而确定了Bam A蛋白是抗菌蛋白PA166抗菌作用的靶点。综上所述,本研究对具有抗P.multocida的活性蛋白PA166进行分离纯化,并对纯化后的稳定性、安全性及杀菌机制进行了初步研究。为活性蛋白PA166的合理应用提供了理论依据。