帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种多发于中老年的中枢神经系统退行性疾病,以运动不能、肌僵直、静止性震颤及姿势反射障碍为特征性表现,其病理学特征是中脑黑质致密带多巴胺能神经元脱失,纹状体多巴胺（dopamine,DA）释放减少。研究显示遗传因素、环境因素和氧化应激等可能参与PD的发病,但其发病机制并不明确。脑内高铁导致黑质-纹状体系统DA能神经元功能的损伤已成为越来越受到神经科学家关注的热点问题。目前PD铁沉积的研究主要集中在DA能神经元,实际上脑内多种胶质细胞在铁稳态调节中也发挥重要作用。星形胶质细胞对铁有极高的耐受能力,铁负载时,神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞铁沉积,而星形胶质细胞却在同样的情况下没有铁的沉积。本室前期研究显示,6-OHDA激活神经元铁调节蛋白（iron regulatory protein,IRP1）,使二价金属离子转运蛋白1（divalent metal transporter1,DMT1）上调,铁转出蛋白Ferroportin1（FPN1）下调,铁转入加快,铁转出减慢,导致铁的沉积。6-OHDA激活星形胶质细胞缺氧诱导因子-2α（hypoxia-inducible factors-2α,HIF-2α）,使DMT1和FPN1上调,铁转入加快,铁转出加快。提示星形胶质细胞与DA能神经元铁代谢的调节机制不同,除自身利用外,可能起“铁泵”的作用。但其具体的分子机制不详。HIFs是铁稳态的重要因子。HIFs由α亚基和β亚基组成具有转录活性的异源二聚体。其中α亚基是HIFs的调节亚基,而β亚基则持续性表达。因此,对HIFs的研究主要集中在HIF-1α和HIF-2α。HIF-2α可与DMT1和FPN1的启动子区的缺氧反应元件（hypoxia-responsive elements,HREs）结合增加DMT1和FPN1的表达。蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）在人宫颈癌HeLa细胞系中调节HIF通路,PKCδ在调节HIFs的过程中起重要作用。那么在星形胶质细胞中,PKC途径是否参与6-OHDA激活HIF-2α,从而使DMT1和FPN1上调?星形胶质细胞铁转运能力的增强是否成为PD黑质DA能神经元乃至整个黑质铁沉积铁的来源?本实验应用原代培养的大鼠星形胶质细胞,观察了PKC途径在HIF-2α铁代谢中的作用。应用Transwell建立星形胶质细胞和神经元共培养体系,观察了星形胶质细胞铁代谢与神经元铁代谢的相互作用及机制。具体结果如下:一、PKC途径参与6-OHDA激活星形胶质细胞HIF-2α。1.0.2μM PMA处理星形胶质细胞24小时,与正常对照组相比,HIF-2α蛋白表达上调（P<0.05,n=6）。4μM Bisl预处理星形胶质细胞24h后,与0.2μMPMA共同作用24 h,PMA/Bisl组与PMA组相比,HIF-2α的蛋白表达降低（P<0.05,n=6）。0.2μM PMA处理星形胶质细胞24小时,与正常对照组相比,DMT1蛋白表达上调（P<0.05,n=6）。PMA/Bisl组与PMA组相比,DMT1的蛋白表达降低（P<0.05,n=6）。0.2μM PMA处理星形胶质细胞24小时,与正常对照组相比,FPN1蛋白表达上调（P<0.05,n=6）。PMA/Bisl组与PMA组相比,FPN1的蛋白表达降低（P<0.05,n=6）。2.10μM 6-OHDA处理星形胶质细胞24小时,与正常对照组相比,HIF-2α蛋白表达上调（P<0.05,n=6）。4μM Bisl预处理星形胶质细胞24h后,与10μM 6-OHDA共同作用24 h,6-OHDA/Bisl组与6-OHDA组相比,HIF-2α的蛋白表达降低（P<0.05,n=6）。10μM 6-OHDA处理星形胶质细胞24小时,与正常对照组相比,DMT1蛋白表达上调（P<0.05,n=6）。6-OHDA/Bisl组与6-OHDA组相比,DMT1的蛋白表达降低（P<0.05,n=6）。10μM 6-OHDA处理星形胶质细胞24小时,与正常对照组相比,FPN1蛋白表达上调（P<0.05,n=6）。6-OHDA/Bisl组与6-OHDA组相比,FPN1的蛋白表达降低（P<0.05,n=6）。二、活性氧（Reactive oxygen species,ROS）和活性氮（reactive nitrogen species,RNS）参与6-OHDA激活星形胶质细胞HIF-2α,可能与PKCδ的激活有关。1.10μM 6-OHDA处理星形胶质细胞24小时,与正常对照组相比,HIF-2α蛋白表达明显上调（P<0.01,n=6）。分别用1 mM NAC和1mM L-NAME预处理星形胶质细胞30min后,与10μM 6-OHDA共同作用24h。6-OHDA/NAC组与6-OHDA组相比,HIF-2α蛋白表达降低（P<0.05,n=6）。6-OHDA/L-NAME组与6-OHDA组相比,HIF-2α蛋白表达降低（P<0.05,n=6）。10μM6-OHDA处理星形胶质细胞24小时,与正常对照组相比,DMT1蛋白表达上调（P<0.05,n=6）。6-OHDA/NAC组与6-OHDA组相比,DMT1蛋白表达降低（P<0.05,n=6）。6-OHDA/L-NAME组与6-OHDA组相比,DMT1蛋白表达明显降低（P<0.01,n=6）。10μM 6-OHDA处理星形胶质细胞24小时,与正常对照组相比,FPN1蛋白表达上调（P<0.05,n=6）。6-OHDA/NAC组与6-OHDA组相比,FPN1蛋白表达降低（P<0.05,n=6）。6-OHDA/L-NAME组与6-OHDA组相比,FPN1蛋白表达降低（P<0.05,n=6）。2.10μM 6-OHDA处理星形胶质细胞24小时,与正常对照组相比,PKCδ的磷酸化水平升高（P<0.05,n=6）。分别用1 mM NAC和1mM L-NAME预处理星形胶质细胞30min后,与10μM 6-OHDA共同作用24h。6-OHDA/NAC组与6-OHDA组相比,PKCδ的磷酸化水平降低（P<0.05,n=6）。6-OHDA/L-NAME组与6-OHDA组相比,PKCδ的磷酸化水平降低（P<0.05,n=6）。三、6-OHDA加快星形胶质细胞铁转运是神经元铁沉积铁的来源。1.星形胶质细胞和神经元共培养体系中,与AS+FAC/N+6-OHDA组相比,给予星形胶质细胞6-OHDA处理（AS+6-OHDA+FAC/N+6-OHDA组）,神经元胞内Fe²⁺含量增加（P<0.05,n=6）。与AS+6-OHDA/N+6-OHDA组相比,给予星形胶质细胞铁（AS+6-OHDA+FAC/N+6-OHDA组）,神经元胞内Fe²⁺含量增加（P<0.05,n=6）。与AS+6-OHDA+FAC/N组相比,给予神经元6-OHDA处理（AS+6-OHDA+FAC/N+6-OHDA组）,神经元胞内Fe²⁺含量显著增加（P<0.01,n=6）。与AS/N组相比,分别给予星形胶质细胞和神经元6-OHDA处理,并给予星形胶质细胞铁（AS+6-OHDA+FAC/N+6-OHDA组）,神经元胞内Fe²⁺含量增加（P<0.05,n=6）。2.星形胶质细胞和神经元共培养体系中,与AS/N组相比,给予神经元6-OHDA处理（AS/N+6-OHDA组）,神经元的IRP1上调（P<0.05,n=6）。与AS/N相比,给予星形胶质细胞6-OHDA处理（AS+6-OHDA/N组）,神经元的IRP1上调（P<0.05,n=6）。与AS/N组相比,分别给予星形胶质细胞和神经元6-OHDA处理（AS+6-OHDA/N+6-OHDA组）,神经元的IRP1显著上调（P<0.01,n=6）。3.星形胶质细胞和神经元共培养体系中,与AS/N组相比,给予神经元6-OHDA处理（AS/N+6-OHDA组）,神经元的DMT1蛋白表达显著升高（P<0.01,n=6）。与AS/N组相比,给予星形胶质细胞6-OHDA处理（AS+6-OHDA/N组）,神经元的DMT1蛋白表达显著升高（P<0.01,n=6）。与AS/N组相比,分别给予星形胶质细胞和神经元6-OHDA处理（AS+6-OHDA/N+6-OHDA组）,神经元的DMT1蛋白表达升高（P<0.05,n=6）。星形胶质细胞和神经元共培养体系中,与AS/N组相比,给予神经元6-OHDA处理（AS/N+6-OHDA组）,神经元的FPN1显著下调（P<0.01,n=6）。与AS/N组相比,给予星形胶质细胞6-OHDA处理（AS+6-OHDA/N组）,神经元的FPN1下调（P<0.05,n=6）。与AS/N组相比,分别给予星形胶质细胞和神经元6-OHDA处理（AS+6-OHDA/N+6-OHDA组）,神经元的FPN1显著下调（P<0.01,n=6）。四、DA能神经元自身氧化产生的6-OHDA加快了星形胶质细胞铁转运过程。1.星形胶质细胞和神经元共培养体系中,与AS/N组相比,AS/N+6-OHDA组的星形胶质细胞内Fe²⁺含量不变（P>0.05,n=6）。与AS/N组相比,AS+6-OHDA/N组的星形胶质细胞内Fe²⁺含量不变（P>0.05,n=6）。与AS/N组相比,AS+6-OHDA/N+6-OHDA组的星形胶质细胞内Fe²⁺含量不变（P>0.05,n=6）。与AS/N组相比,AS+FAC/N组的星形胶质细胞内Fe²⁺含量不变（P>0.05,n=6）。与AS/N组相比,AS+FAC/N+6-OHDA组的星形胶质细胞内Fe²⁺含量不变（P>0.05,n=6）。与AS/N组相比,AS+6-OHDA+FAC/N组的星形胶质细胞内Fe²⁺含量不变（P>0.05,n=6）。与AS/N组相比,AS+6-OHDA+FAC/N+6-OHDA组的星形胶质细胞内Fe²⁺含量不变（P>0.05,n=6）。2.星形胶质细胞和神经元共培养体系中,与AS/N组相比,给予神经元6-OHDA处理（AS/N+6-OHDA组）,星形胶质细胞的HIF-2α上调（P<0.05,n=6）。与AS/N组相比,给予星形胶质细胞6-OHDA处理（AS+6-OHDA/N）,星形胶质细胞的HIF-2α上调（P<0.05,n=6）。与AS/N组相比,分别给予星形胶质细胞和神经元6-OHDA处理（AS+6-OHDA/N+6-OHDA组）,星形胶质细胞的HIF-2α上调（P<0.05,n=6）。3.星形胶质细胞和神经元共培养体系中,与AS/N组相比,给予神经元6-OHDA处理（AS/N+6-OHDA组）,星形胶质细胞的DMT1蛋白表达升高（P<0.05,n=6）。与AS/N组相比,给予星形胶质细胞6-OHDA处理（AS+6-OHDA/N）,星形胶质细胞的DMT1蛋白表达升高（P<0.05,n=6）。与AS/N组相比,分别给予星形胶质细胞和神经元6-OHDA处理（AS+6-OHDA/N+6-OHDA组）,星形胶质细胞的DMT1蛋白表达升高（P<0.05,n=6）。星形胶质细胞和神经元共培养体系中,与AS/N组相比,给予神经元6-OHDA处理（AS/N+6-OHDA组）,星形胶质细胞的FPN1升高（P<0.05,n=6）。与AS/N组相比,给予星形胶质细胞6-OHDA处理（AS+6-OHDA/N组）,星形胶质细胞的FPN1显著升高（P<0.01,n=6）。与AS/N组相比,分别给予星形胶质细胞和神经元6-OHDA处理（AS+6-OHDA/N+6-OHDA组）,星形胶质细胞的FPN1显著升高（P<0.01,n=6）。上述结果表明,在星形胶质细胞中,PKC途径参与6-OHDA对星形胶质细胞HIF-2α的激活,可能与ROS和NO激活PKCδ有关,从而上调DMT1和FPN1表达,使铁转运能力增强。星形胶质细胞铁转运能力的增强起到“铁泵”的作用,6-OHDA加快星形胶质细胞铁转运是神经元铁沉积铁的来源。黑质DA自身氧化应激可能加快了星形胶质细胞铁转运过程,导致黑质DA神经元铁沉积,进而造成神经元变性死亡,引起PD。本研究结合transwell细胞共培养系统和经典的PD细胞模型,明确细胞层面上神经元铁的来源,铁转运的方向性等问题,使星形胶质细胞将可能成为潜在的PD防治的新靶点。