【摘 要】
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目的:应用噬菌体12肽库筛选泡球蚴Em18抗原的模拟表位,为研究和开发特异、灵敏的包虫病诊断抗原提供实验依据。方法:IPTG诱导、表达和纯化重组蛋白Em18-GST,SDS-PAGE电泳进行
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目的:应用噬菌体12肽库筛选泡球蚴Em18抗原的模拟表位,为研究和开发特异、灵敏的包虫病诊断抗原提供实验依据。方法:IPTG诱导、表达和纯化重组蛋白Em18-GST,SDS-PAGE电泳进行初步鉴定。将纯化后的rEm18-GST蛋白作为免疫原,免疫兔获得抗rEm18-GST的多克隆抗体,ELISA检测其效价。将抗体用镍.螫合物亲和层析树脂His Bind Ni Resin(His柱)进一步纯化,Western blot及ELISA进行鉴定。以Em18抗体作为靶分子,筛选噬菌体随机12肽库。随机挑取19个噬菌斑进行扩增,提取单链DNA,凝胶电泳鉴定并送测序,分析其获得的DNA序列及编码的氨基酸序列,并与Em18进行同源性比较。结果:rEm18-GST重组蛋白得到成功表达,在相对分子量为50kDa处有表达条带。获得非特异性杂带少纯度高的rEm18-GST重组蛋白。经5次免疫获得兔抗tEm18-GST抗体,ELISA检测抗体最终效价为1:51200。Western blot及ELISA鉴定rEm18-GST抗体去除了与GST的交叉反应,保留有抗Em18抗体。经5轮肽库筛选,所获得的噬菌体克隆有较高程度的富集,第5轮筛选回收的噬菌体比第1轮高出约1000倍。19个克隆测序后发现主要有四个不同序列。其插入片段的DNA序列分别为:序列1:GTTGCGGCTTCTCCTAAGTGGACTAATCTTGAGTGG(f1-f4,f10)序列2:CATTCGAAGTGGCATATTCCGTCTGAGTGGCATGTG(f5-f9)序列3:CAGCATGGGCATAAGATTTGGTCGCCGAGTTATGTT(f11-f12,f14)序列4:CATCATTGGAGTTATTTTTATATTTTGGAGAGTCCG(f13,f15-f19),将获得的四个序列与Em18比较,发现没有同源性。结论:获得了去除与GST交叉反应的抗Em18多克隆抗体:筛选获得的噬菌体12肽,与Em18比较无同源性,是否为Em18抗原的模拟表位还需要进一步研究。
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