目的：近来，黑素瘤特异性抗原-1（MAGE-1）、BAGE、GAGE和LAGE/NY-ESO-1等癌/睾丸抗原基因（cancer-testis antigen ，CTA）的鉴定表明，其共同特点是在多种肿瘤组织中表达，而睾丸和胎盘除外的正常组织均无表达。肿瘤/睾丸抗原具有肿瘤特异性，该基因产物是一种肿瘤排斥抗原，能诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）特异性识别和杀伤肿瘤细胞，这一特点使CTA可能成为肿瘤免疫治疗的靶基因，并在肿瘤的早期诊断及治疗中具有重要意义。癌症相关基因（cancer-associated gene，CAGE）是2002年Cho等人发现的一个新的CTA基因，并发现CAGE在胃癌组织、宫颈癌组织、肺癌组织及多种肿瘤细胞系中均有过度表达，其中大肠癌细胞系50%表达，而它们对应的正常组织未见CAGE表达。但未做大肠癌组织及腺瘤方面<WP=30>研究，目前国内尚未发现有关CAGE方面的研究及报告。本研究应用半定量的RT-PCR（reverse transcription-PCR）方法检测CAGE在大肠癌、大肠腺瘤及大肠正常黏膜中的表达，比较其表达差异；同时应用MSP（methylation-specific PCR）方法检测CAGE启动子在大肠癌、大肠腺瘤及大肠正常黏膜中的甲基化情况。以了解CAGE在大肠癌早期发生、发展及细胞增殖中的作用。CAGE编码的抗原是一个新的肿瘤/睾丸抗原。此抗原作为新的肿瘤特异性抗原及其编码基因的发现，将为肿瘤抗原和肿瘤免疫诊治研究提供了新的途径，有可能成为癌症早期诊断的生物标志物，也可能成为肿瘤治疗的一种新途径。材料与方法：RT-PCR法检测CAGE在mRNA水平的表达 1.研究对象 大肠癌、大肠腺瘤共46份活检组织标本均取自2003年4月-2003年12月我院肠镜室肠镜检查的患者。对应10份正常黏膜组织取自距肿瘤10cm以外的部位。将活检标本Eppendorf管中，-70℃冰箱保存。 <WP=31> 2.总RNA提取按TRIZOL试剂盒说明书进行。3.引物序列 CAGE（300bp）意义链5′-GGT GCC GAT ACT CCC ACT AT-3′；反意义链5′-TTG CTT CAG ATT CCC CGT TT-3′。设GAPDH内参照（230bp），意义链5′-TGA TTT TGG AGG GAT CTC GC-3′，反意义链5′-ACG GAT TTG GTC GTA TTG GG-3′。均由购自大连宝生物公司，TaKaRa合成。4.逆转录合成cDNA第一链 20ul反应体系。RT反应条件为：37℃温育1h，90℃5min终止反应。5.PCR扩增 总反应体系为25μl。循环参数： 94℃变性2min后，94℃30s；60℃45s；72℃60s；35个循环，最后72℃延伸10min。6.PCR产物鉴定 将扩增的CAGE及GAPDH PCR产物一起于2%琼脂糖凝胶电泳（40′-60′，60V），测相对含量；同时设标志物为100bp Ladder（TaKaRa公司）。电泳后，经凝胶成像分析系统摄影，用相应软件扫描测定PCR产物经溴化乙锭染色后强度。7.统计学分析 实验数据采用均数±标准差（X±s）表示。计数资料采用χ2检验，计量资料采用F分析和t检验，以上均在SPSS软件上进行。MSP（ methylation-specific PCR）方法检测CAGE<WP=32>基因启动子甲基化情况 1.研究对象 大肠癌、大肠腺瘤共46份活检组织标本均取自2003年4月-2003年12月我院肠镜室肠镜检查的患者，对应10份正常黏膜组织取自距肿瘤10cm以外的部位。置于Eppendorf管中，-70℃冰箱保存。2.DNA抽提 肿瘤组织、正常组织DNA的分离用饱和盐析法。3.按照Herman方法进行DNA修饰。4. Wizard DNA纯化树脂（Promega）提纯DNA。 5.CAGE启动子5′CpG岛甲基化分析 ，检测CAGE启动子甲基化的引物，意义链5′-TTT TAT ACG ATT CGG AAT TCG AC-3′，反意义链5′-CAA ATC TAC GAC CTA TTT CCC G-3′；检测非甲基化等位基因引物为：意义链5′-GTT TTT TAT ATG ATT TGG AAT TTG AT-3′，反意义链5′-AAT TCA AAT CTA CAA CCT ATT TCC CA-3′。6.分别进行PCR扩增，总反应体系50μl，放置于PCR仪中。反应热启动95℃，5min后，加入Taq DNA聚合酶1.25单位，30个循环，94℃30s；57℃30s；72℃60s；最后72℃延伸4min。7.取PCR产物10μl，加到6-8%非变性聚丙烯酰胺<WP=33>凝胶电泳，溴化乙啶染色，紫外线照明显色。8.统计学分析 所得数据采用χ2检验。结 果：一、RT-PCR法检测CAGE在mRNA水平的表达1.CAGEmRNA定性检测结果 RT-PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，大肠癌及大肠腺瘤组织的电泳带亮而宽，而正常组织未见明显电泳带，表明大肠癌及大肠腺瘤中被扩增产物多于正常组织。CAGE在大肠癌、大肠腺瘤中的表达均明显高于正常组织（P<0.01），但二者间差异不显著（P>.05）。2.CAGEmRNA定量检测结果 大肠癌、大肠腺瘤及正常组织均有不同程度的CAGEmRNA表达，从相对含量来看以大肠癌中为最高，腺瘤居中，正常组织最少。CAGE在大肠癌中的相对含量高于大肠腺瘤（P<0.05），大肠癌和大肠腺瘤中的相对含量均高于正常组织（P<0.01）。二、MSP方法检测CAGE基因启动子甲基化情况DNA提取后经重亚硫酸钠修饰、提纯，进行PCR扩增，产物经8%琼脂糖凝胶电泳后，大肠癌（100%）和腺瘤（100%）组织中其启动子呈去甲基化状态，并导致该基因的过度表达，而正常组织的启动子为甲基化<WP=34>表现。而且去甲基化比例也呈大肠腺瘤伴有不典型增生到腺癌逐渐增高趋势。讨论：