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目的：
脓毒症3.0定义宿主对感染的反应失调，产生危及生命的器官功能损害。脓毒症的发病机理复杂，多器官功能衰竭是脓毒症和脓毒症休克早期死亡的主要因素之一[1]。侵袭性感染的炎症反应失调，仍为脓毒症触发事件，其与持续过度炎症和免疫抑制以及难以恢复正常的自稳态密切相关。自噬是高度保守的自稳态过程，参与脓毒症的发生与发展。近年来越来越多的学者认为氢气可做为一种新型的医学气体分子，发挥对脓毒症的保护作用。本课题利用离体和在体脓毒症动物模型，观察H2对脓毒症及相关器官损伤的保护作用，并探讨自噬调控的分子机制在这一治疗中的具体作用。
方法：
第一部分实验：PINK1/Parkin介导线粒体自噬在H2减轻脓毒症诱发细胞和器官损伤中的作用研究
离体实验：小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，接种于6孔或96孔细胞培养板，3mL/孔或200μL/孔，细胞密度2×106/mL。首先，给予LPS和富氢液处理，6h和24h，收集细胞检测膜电位、电镜观察自噬体，Westernblot检测PINK1、Parkin和LC3的表达，免疫荧光检测PINK1和LC3的定位表达。其次，给予细胞LPS和富氢培养液处理6h，检测细胞活性，LDH的释放，膜电位和ROS的释放。透射电镜观察自噬体，Westernblot检测PINK1、Parkin、LC3、P62、Beclin1和VDAC的表达，免疫荧光检测PINK1和LC3的定位表达。最后给予细胞PINK1的shRNA转染处理，再给予细胞LPS和富氢培养液处理，透射电镜观察自噬体、检测细胞活性，膜电位和ROS的释放，ELISA检测TNF-α和HMGB1的表达，Westernblot检测PINK1、Parkin、LC3、P62和VDAC的表达，免疫荧光检测PINK1和LC3的定位表达。
在体实验：6～8周龄健康雄性C57BL/6小鼠，SPF级，体重20～25g，利用盲肠结扎穿刺法诱导脓毒症小鼠模型，于模型后1h和6h分别给予饱和富氢生理盐水5ml/kg腹腔注射。术前给予小鼠尾静脉PINK1shRNA质粒转染。于术后24h，检测肺W/D、PaO2/FiO2、肺MPO活性，线粒体ROS的释放，和HE肺组织染色评分。透射电镜检测肺组织自噬体，westernblot检测PINK1、Parkin、LC3、P62和VDAC的表达。
第二部分实验：H2通过自噬介导炎症小体NLRP3的灭活缓解线粒体功能障碍
离体实验：提取原代小鼠肺泡巨噬细胞，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，接种于6孔或96孔细胞培养板，3mL/孔或200μL/孔，细胞密度2×106/mL。
首先，给予细胞LPS和ATP处理6h，ELISA法检测IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6的表达，Westernblot检测Caspase-1、NLRP3和ASC的表达。检测MMP、RCR、ATP含量和mtDNA的含量。其次，给予细胞LPS、ATP和富氢培养液处理，Westernblot检测PINK1、Parkin、LC3、Beclin1和VDAC的表达。最后，给予细胞LPS和富氢液，以及自噬激动剂Rap和抑制剂3-MA处理，ELISA法检测IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6的表达，Westernblot检测Caspase-1、NLRP3和ASC的表达，检测MMP、RCR、ATP含量和mtDNA的含量。
在体实验：6～8周龄健康雄性C57BL/6小鼠，SPF级，体重20～25g，利用CLP法诱导脓毒症小鼠模型，于模型后1h和6h分别给予饱和富氢生理盐水5ml/kg腹腔注射。术前给予小鼠腹腔注射自噬激动剂Rap和抑制剂3-MA处理。于术后24h，检测肺W/D、肺MPO活性、BAL总蛋白含量、肺、肝和肾组织的HE病理学检测及评分、血清生化指标ALT、AST、Cr和BUN的含量，以及小鼠1、2、3、5和7d生存率，以及ELISA法检测IL-1β、IL-18和TNF-α的表达，Westernblot法检测肺肝肾组织Caspase-1、NLRP3和ASC的表达。
第三部分实验：H2减轻器官损伤和功能障碍的机制：自噬与ERS的串话。
6～8周龄健康雄性C57BL/6小鼠，SPF级，体重20～25g，利用盲肠结扎穿刺法诱导脓毒症小鼠模型，于模型后1h和6h分别给予饱和富氢生理盐水5ml/kg腹腔注射。第一，于不同时间点，收集肺组织，Westernblot法检测肺组织PERK和eIF2α、p-PERK和p-eIF2α和IRE1α的表达。第二，CLP术前给予4-PBA和TM处理，再行CLP和饱和富氢生理盐水处理，Westernblot法检测肺组织PERK、eIF2α、p-PERK、p-eIF2α、CHOP、ATF、IRE1α、XBP1的表达。收集肺、肝和肾组织，Westernblot法检测组织LC3、Beclin1、PINK1和Parkin的表达，透射电镜观察肝组织自噬体，肺、肝和肾组织HE染色观察和进行组织病理学评分的检测，检测肺组织MPO、BAL总蛋白含量、肺W/D和血清生化指标ALT、AST、Cr和BUN的含量，以及小鼠1、2、3、5和7d生存率。第三，CLP术前给予Rap和3-MA处理，再行CLP和饱和富氢生理盐水处理，Westernblot法检测肺、肝和肾组织p-PERK、p-eIF2α、CHOP、ATF、IRE1α、XBP1的表达。第四，CLP术前给予TM和3-MA处理，再行CLP和饱和富氢生理盐水处理，Westernblot法检测肺组织p-PERK、p-eIF2α、IRE1α、XBP1、LC3、Beclin1和核蛋白NF-κb的表达，ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1的表达，肺、肝和肾组织HE染色观察和进行组织病理学评分的检测，检测肺组织MPO、BAL总蛋白含量、肺W/D和血清生化指标ALT、AST、Cr和BUN的含量，以及小鼠1、2、3、5和7d生存率。
结果
第一部分PINK1/Parkin介导线粒体自噬在H2减轻脓毒症诱发细胞和器官损伤中的作用研究
LPS导致巨噬细胞膜电位下降，自噬体增加，PINK1、Parkin和LC3表达增加，PINK1和LC3共定位表达增加，细胞活性下降，LDH和ROS释放增加。与LPS组比较，致细胞活性增加，LDH和ROS释放减少，膜电位上升，自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3、P62、Beclin1和VDAC表达进一步增加，PINK1和LC3共定位表达进一步增加。与LPS+H2组比较，LPS+H2+shRNA组PINK1shRNA处理后自噬体减少，膜电位下降，LDH和ROS释放增加，炎症介质TNF-α和HMGB1表达增加，自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3、P62和VDAC表达减少，PINK1和LC3共定位表达减少。与CLP组比较，H2处理致肺损伤评分减少，肺W/D、PaO2/FiO2、肺MPO活性、线粒体ROS的释放减少，肺组织自噬体增加，肺组织自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3、P62和VDAC表达增加。与CLP+H2组比较，LPS+H2+shRNA组上述指标恶化。
第二部分H2通过自噬介导炎症小体NLRP3的灭活缓解线粒体功能障碍
LPS和ATP增加了炎症介质IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6和Caspase-1P-10、NLRP3和ASC，自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3、Beclin1和VDAC的表达，降低MMP、RCT、ATP含量和增加了mtDNA的含量，H2降低了IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6和Caspase-1P-10、NLRP3和ASC的表达，增加自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3、Beclin1和VDAC的表达，增加了MMP、RCR、ATP含量和减少了mtDNA的含量。与LPS+H2组相比，LPS+H2+Rap组降低了了炎症介质IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6和Caspase-1P-10、NLRP3和ASC的表达，增加了MMP、RCT、ATP含量和减少了mtDNA的含量，LPS+H2+3-MA组增加了炎症介质IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6和，降低了MMP、RCT、ATP含量和增加了mtDNA的含量。与CLP组比较，CLP+H2组减少了肺、肝和肾组织病理学评分，减轻了肺、肝和肾功能障碍，增加了小鼠生存率，增加了肺肝肾组织炎症介质IL-1β、IL-18、TNF-α和Caspase-1P-10、NLRP3和ASC的表达。与CLP+H2组比较，CLP+H2+Rap组进一步减少了肺、肝和肾组织病理学评分，减轻了肺、肝和肾功能障碍，增加了小鼠生存率，减轻了肺肝肾组织炎症介质IL-1β、IL-18、TNF-α和Caspase-1P-10、NLRP3和ASC的表达；CLP+H2+3-MA组增加了肺、肝和肾组织病理学评分，加重了肺、肝和肾功能障碍，减少了小鼠生存率，加重了肺肝肾组织炎症介质IL-1β、IL-18、TNF-α和Caspase-1P-10、NLRP3和ASC的表达。
第三部分H2减轻器官损伤和功能障碍的机制：自噬与ERS的串话。
CLP导致肺组织p-PERK、p-eIF2α和IRE1α表达增加。TM处理脓毒症小鼠，促进p-PERK、p-eIF2α、IRE1α、CHOP、ATF、XBP-1表达增加，抑制LC3、Beclin1、PINK1和Parkin的表达，减少自噬体数量，加重肺、肝和肾组织的病理评分、器官功能障碍和降低生存率；4-PBA处理脓毒症小鼠，改善上述指标的变化。3-MA处理脓毒症小鼠，增加肺、肝和肾组织p-PERK、p-eIF2α、IRE1α、CHOP、ATF、XBP-1表达；Rap处理脓毒症小鼠，减少上述指标的变化。H2处理减少脓毒症小鼠p-PERK、p-eIF2α、IRE1α、XBP-1、NF-κb、TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1的表达，增加LC3和Beclin1的表达，减少了肺、肝和肾组织病理学评分，减轻了肺、肝和肾功能障碍，增加了小鼠生存率。TM或3-MA的处理逆转了H2对上述指标的调控作用。
结论：
H2通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬发挥对LPS导致的巨噬细胞线粒体功能障碍的保护作用。H2通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬发挥对脓毒症肺组织线粒体功能障碍和肺损伤的保护作用。H2通过自噬介导NLRP3炎性小体途径改善LPS导致的巨噬细胞线粒体功能障碍。H2通过自噬介导NLRP3炎性小体途径改善脓毒症小鼠肺、肝和肾功能障碍和器官损伤，提高脓毒症小鼠的生存率。脓毒症可诱发内质网应激和自噬的活性。H2可减轻脓毒症小鼠的ERS，提高自噬的活性。H2通过ERS的灭活和自噬途径增强的串话作用，减轻脓毒症小鼠重要器官炎症反应、病理学损伤、器官功能障碍和提高小鼠生存率。
脓毒症3.0定义宿主对感染的反应失调，产生危及生命的器官功能损害。脓毒症的发病机理复杂，多器官功能衰竭是脓毒症和脓毒症休克早期死亡的主要因素之一[1]。侵袭性感染的炎症反应失调，仍为脓毒症触发事件，其与持续过度炎症和免疫抑制以及难以恢复正常的自稳态密切相关。自噬是高度保守的自稳态过程，参与脓毒症的发生与发展。近年来越来越多的学者认为氢气可做为一种新型的医学气体分子，发挥对脓毒症的保护作用。本课题利用离体和在体脓毒症动物模型，观察H2对脓毒症及相关器官损伤的保护作用，并探讨自噬调控的分子机制在这一治疗中的具体作用。
方法：
第一部分实验：PINK1/Parkin介导线粒体自噬在H2减轻脓毒症诱发细胞和器官损伤中的作用研究
离体实验：小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，接种于6孔或96孔细胞培养板，3mL/孔或200μL/孔，细胞密度2×106/mL。首先，给予LPS和富氢液处理，6h和24h，收集细胞检测膜电位、电镜观察自噬体，Westernblot检测PINK1、Parkin和LC3的表达，免疫荧光检测PINK1和LC3的定位表达。其次，给予细胞LPS和富氢培养液处理6h，检测细胞活性，LDH的释放，膜电位和ROS的释放。透射电镜观察自噬体，Westernblot检测PINK1、Parkin、LC3、P62、Beclin1和VDAC的表达，免疫荧光检测PINK1和LC3的定位表达。最后给予细胞PINK1的shRNA转染处理，再给予细胞LPS和富氢培养液处理，透射电镜观察自噬体、检测细胞活性，膜电位和ROS的释放，ELISA检测TNF-α和HMGB1的表达，Westernblot检测PINK1、Parkin、LC3、P62和VDAC的表达，免疫荧光检测PINK1和LC3的定位表达。
在体实验：6～8周龄健康雄性C57BL/6小鼠，SPF级，体重20～25g，利用盲肠结扎穿刺法诱导脓毒症小鼠模型，于模型后1h和6h分别给予饱和富氢生理盐水5ml/kg腹腔注射。术前给予小鼠尾静脉PINK1shRNA质粒转染。于术后24h，检测肺W/D、PaO2/FiO2、肺MPO活性，线粒体ROS的释放，和HE肺组织染色评分。透射电镜检测肺组织自噬体，westernblot检测PINK1、Parkin、LC3、P62和VDAC的表达。
第二部分实验：H2通过自噬介导炎症小体NLRP3的灭活缓解线粒体功能障碍
离体实验：提取原代小鼠肺泡巨噬细胞，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，接种于6孔或96孔细胞培养板，3mL/孔或200μL/孔，细胞密度2×106/mL。
首先，给予细胞LPS和ATP处理6h，ELISA法检测IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6的表达，Westernblot检测Caspase-1、NLRP3和ASC的表达。检测MMP、RCR、ATP含量和mtDNA的含量。其次，给予细胞LPS、ATP和富氢培养液处理，Westernblot检测PINK1、Parkin、LC3、Beclin1和VDAC的表达。最后，给予细胞LPS和富氢液，以及自噬激动剂Rap和抑制剂3-MA处理，ELISA法检测IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6的表达，Westernblot检测Caspase-1、NLRP3和ASC的表达，检测MMP、RCR、ATP含量和mtDNA的含量。
在体实验：6～8周龄健康雄性C57BL/6小鼠，SPF级，体重20～25g，利用CLP法诱导脓毒症小鼠模型，于模型后1h和6h分别给予饱和富氢生理盐水5ml/kg腹腔注射。术前给予小鼠腹腔注射自噬激动剂Rap和抑制剂3-MA处理。于术后24h，检测肺W/D、肺MPO活性、BAL总蛋白含量、肺、肝和肾组织的HE病理学检测及评分、血清生化指标ALT、AST、Cr和BUN的含量，以及小鼠1、2、3、5和7d生存率，以及ELISA法检测IL-1β、IL-18和TNF-α的表达，Westernblot法检测肺肝肾组织Caspase-1、NLRP3和ASC的表达。
第三部分实验：H2减轻器官损伤和功能障碍的机制：自噬与ERS的串话。
6～8周龄健康雄性C57BL/6小鼠，SPF级，体重20～25g，利用盲肠结扎穿刺法诱导脓毒症小鼠模型，于模型后1h和6h分别给予饱和富氢生理盐水5ml/kg腹腔注射。第一，于不同时间点，收集肺组织，Westernblot法检测肺组织PERK和eIF2α、p-PERK和p-eIF2α和IRE1α的表达。第二，CLP术前给予4-PBA和TM处理，再行CLP和饱和富氢生理盐水处理，Westernblot法检测肺组织PERK、eIF2α、p-PERK、p-eIF2α、CHOP、ATF、IRE1α、XBP1的表达。收集肺、肝和肾组织，Westernblot法检测组织LC3、Beclin1、PINK1和Parkin的表达，透射电镜观察肝组织自噬体，肺、肝和肾组织HE染色观察和进行组织病理学评分的检测，检测肺组织MPO、BAL总蛋白含量、肺W/D和血清生化指标ALT、AST、Cr和BUN的含量，以及小鼠1、2、3、5和7d生存率。第三，CLP术前给予Rap和3-MA处理，再行CLP和饱和富氢生理盐水处理，Westernblot法检测肺、肝和肾组织p-PERK、p-eIF2α、CHOP、ATF、IRE1α、XBP1的表达。第四，CLP术前给予TM和3-MA处理，再行CLP和饱和富氢生理盐水处理，Westernblot法检测肺组织p-PERK、p-eIF2α、IRE1α、XBP1、LC3、Beclin1和核蛋白NF-κb的表达，ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1的表达，肺、肝和肾组织HE染色观察和进行组织病理学评分的检测，检测肺组织MPO、BAL总蛋白含量、肺W/D和血清生化指标ALT、AST、Cr和BUN的含量，以及小鼠1、2、3、5和7d生存率。
结果
第一部分PINK1/Parkin介导线粒体自噬在H2减轻脓毒症诱发细胞和器官损伤中的作用研究
LPS导致巨噬细胞膜电位下降，自噬体增加，PINK1、Parkin和LC3表达增加，PINK1和LC3共定位表达增加，细胞活性下降，LDH和ROS释放增加。与LPS组比较，致细胞活性增加，LDH和ROS释放减少，膜电位上升，自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3、P62、Beclin1和VDAC表达进一步增加，PINK1和LC3共定位表达进一步增加。与LPS+H2组比较，LPS+H2+shRNA组PINK1shRNA处理后自噬体减少，膜电位下降，LDH和ROS释放增加，炎症介质TNF-α和HMGB1表达增加，自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3、P62和VDAC表达减少，PINK1和LC3共定位表达减少。与CLP组比较，H2处理致肺损伤评分减少，肺W/D、PaO2/FiO2、肺MPO活性、线粒体ROS的释放减少，肺组织自噬体增加，肺组织自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3、P62和VDAC表达增加。与CLP+H2组比较，LPS+H2+shRNA组上述指标恶化。
第二部分H2通过自噬介导炎症小体NLRP3的灭活缓解线粒体功能障碍
LPS和ATP增加了炎症介质IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6和Caspase-1P-10、NLRP3和ASC，自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3、Beclin1和VDAC的表达，降低MMP、RCT、ATP含量和增加了mtDNA的含量，H2降低了IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6和Caspase-1P-10、NLRP3和ASC的表达，增加自噬蛋白PINK1、Parkin、LC3、Beclin1和VDAC的表达，增加了MMP、RCR、ATP含量和减少了mtDNA的含量。与LPS+H2组相比，LPS+H2+Rap组降低了了炎症介质IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6和Caspase-1P-10、NLRP3和ASC的表达，增加了MMP、RCT、ATP含量和减少了mtDNA的含量，LPS+H2+3-MA组增加了炎症介质IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-6和，降低了MMP、RCT、ATP含量和增加了mtDNA的含量。与CLP组比较，CLP+H2组减少了肺、肝和肾组织病理学评分，减轻了肺、肝和肾功能障碍，增加了小鼠生存率，增加了肺肝肾组织炎症介质IL-1β、IL-18、TNF-α和Caspase-1P-10、NLRP3和ASC的表达。与CLP+H2组比较，CLP+H2+Rap组进一步减少了肺、肝和肾组织病理学评分，减轻了肺、肝和肾功能障碍，增加了小鼠生存率，减轻了肺肝肾组织炎症介质IL-1β、IL-18、TNF-α和Caspase-1P-10、NLRP3和ASC的表达；CLP+H2+3-MA组增加了肺、肝和肾组织病理学评分，加重了肺、肝和肾功能障碍，减少了小鼠生存率，加重了肺肝肾组织炎症介质IL-1β、IL-18、TNF-α和Caspase-1P-10、NLRP3和ASC的表达。
第三部分H2减轻器官损伤和功能障碍的机制：自噬与ERS的串话。
CLP导致肺组织p-PERK、p-eIF2α和IRE1α表达增加。TM处理脓毒症小鼠，促进p-PERK、p-eIF2α、IRE1α、CHOP、ATF、XBP-1表达增加，抑制LC3、Beclin1、PINK1和Parkin的表达，减少自噬体数量，加重肺、肝和肾组织的病理评分、器官功能障碍和降低生存率；4-PBA处理脓毒症小鼠，改善上述指标的变化。3-MA处理脓毒症小鼠，增加肺、肝和肾组织p-PERK、p-eIF2α、IRE1α、CHOP、ATF、XBP-1表达；Rap处理脓毒症小鼠，减少上述指标的变化。H2处理减少脓毒症小鼠p-PERK、p-eIF2α、IRE1α、XBP-1、NF-κb、TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1的表达，增加LC3和Beclin1的表达，减少了肺、肝和肾组织病理学评分，减轻了肺、肝和肾功能障碍，增加了小鼠生存率。TM或3-MA的处理逆转了H2对上述指标的调控作用。
结论：
H2通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬发挥对LPS导致的巨噬细胞线粒体功能障碍的保护作用。H2通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬发挥对脓毒症肺组织线粒体功能障碍和肺损伤的保护作用。H2通过自噬介导NLRP3炎性小体途径改善LPS导致的巨噬细胞线粒体功能障碍。H2通过自噬介导NLRP3炎性小体途径改善脓毒症小鼠肺、肝和肾功能障碍和器官损伤，提高脓毒症小鼠的生存率。脓毒症可诱发内质网应激和自噬的活性。H2可减轻脓毒症小鼠的ERS，提高自噬的活性。H2通过ERS的灭活和自噬途径增强的串话作用，减轻脓毒症小鼠重要器官炎症反应、病理学损伤、器官功能障碍和提高小鼠生存率。