蛋白质N-糖基化修饰是真核生物中最常见的翻译后修饰之一,其影响着蛋白质的结构和功能,包括蛋白质的折叠、分子识别、稳定性以及免疫原性等。然而,在哺乳动物细胞中表达生产重组蛋白仍然面临着一些难题。其中最主要问题是重组蛋白上N-聚糖的异质性,这会对重组蛋白的功能和稳定性产生不利影响,如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用以及重组蛋白在体内的半衰期等。目前,随着基因编辑技术,细胞工程以及糖工程等多门学科的发展,可针对蛋白质糖基化位点和其上修饰的聚糖结构进行改造,来减少甚至消除N-聚糖的异质性,进而改善重组蛋白的特性。因此,构建适用于生产均一糖基化修饰重组蛋白的哺乳动物细胞表达系统已成为生物药物行业的研究热门。本研究的主要结果如下:1.基于CRISPR Cas9基因编辑技术在人胚肾细胞293（HEK293）内首先敲除N-糖基化途径中高尔基体甘露糖苷酶Ⅱ（MAN2A1/A2）,阻断复杂型N-聚糖的合成,得到双基因敲除细胞株M2D-KO。随后进一步敲除α1,6-岩藻糖基转移酶（FUT8）去除核心岩藻糖修饰,最终得到三基因敲除细胞株DF-KO。2.通过凝集素染色和细胞膜N-聚糖质谱分析技术鉴定敲除细胞株细胞膜上N-聚糖结构,结果表明两株敲除细胞均无法合成复杂型N-聚糖。双基因敲除细胞株M2D-KO细胞膜上N-聚糖以含有核心岩藻糖修饰的杂合型N-聚糖为主,而三基因敲除细胞株DF-KO细胞膜上N-聚糖以不含有核心岩藻糖修饰的杂合型N-聚糖为主。随后在两株敲除细胞株内表达分泌型重组蛋白溶酶体酸性脂肪酶（lysosomal acid lipase A,LIPA）和Fc。两种重组蛋白经纯化后,使用外切糖苷酶处理和质谱分析技术鉴定其N-糖基化修饰,结果显示M2D-KO和DF-KO细胞株表达的重组蛋白上N-聚糖分布与其细胞膜上的基本一致。3.为进一步降低DF-KO细胞株中高甘露糖型的水平,本研究分别通过在DF-KO细胞株中过表达编码曲霉Aspergillus saitoi菌株以及人源的α1,2-甘露糖苷酶的基因MsdS和MAN1A2。质谱结果显示过表达编码人源的α1,2-甘露糖苷酶基因MAN1A2降低了细胞中高甘露糖型的表达。因此,本研究成功构建了表达均一杂合型N-聚糖修饰的细胞株,为工业生产医药糖蛋白或重组蛋白提供了理论基础。