近年来，癌症已成为全球最大致死原因。严峻的形势使得癌症的防治刻不容缓。目前，随着生物及医学研究技术的发展，肿瘤免疫治疗逐渐被广泛用于癌症的临床治疗。而肿瘤疫苗是肿瘤免疫疗法的研究热点之一，现在所研发的疫苗以治疗型居多。其中多肽疫苗作为治疗型肿瘤疫苗，具有高特异性、易于人工合成，使其在抗肿瘤研究中受到愈多的关注。多肽疫苗的设计核心是T细胞表位，其鉴定和改造是多肽疫苗发展及应用的基础。目的本课题的研究目的是预测、筛选及鉴定来源于癌/睾丸抗原CTNNA2的HLA-A2限制性的CD8+CTL表位。同时对4位是丝氨酸的表位，尝试磷酸化修饰，即在此位引入磷酸化的丝氨酸，并探讨对表位免疫原性的影响。方法首先，我们通过使用免费在线预测工具BIMAS、NetCTL1.2及SYFPEITHI进行预测，得到CTNNA2来源的HLA-A2限制性CTL表位，同时尝试磷酸化的引入。然后，将预测得到的9肽序列，经固相Fmoc法合成，RP-HPLC色谱法纯化，质谱仪分析得到候选肽的分子量。其次，使用T2细胞，通过亲和力测定及复合物稳定性分析，对所有的CTNNA2候选表位进行筛选。RT-PCR分析肿瘤细胞中CTNNA2的表达，筛选得到靶细胞。最后，对3名健康者的外周血单核细胞进行分离及诱导培养，得到特异性的效应细胞。通过ELISPOT、ICS及细胞毒活性等实验来研究CTNNA2表位的免疫原性。结果1.综合三种预测工具BIMAS、NetCTL1.2和SYFPEITHI，选择11条CTNNA2来源的短肽表位，分别是：P129（ALLSAVTRL）、P138（LILADMADV）、P148（RLLSHLKIV）、P279（ALNEFDNKI）、P345（LLSEYMNNT）、P495（VLTEAVDDI）、 P569（KVLEATKLL）、 P581（VMPRFAEQV）、 P721（IMMEMTDFT）、P779（LMNAVVLTV）和P784（VLTVKASYV），同时在P129和P148的4位处引入磷酸化的Ser。经Fmoc法合成，质谱验证所有肽的分子量。2.源于CTNNA2的P148和P581的实验结果FI>1.5，可说明亲和力高；P129、P138、P345和P721这4条肽的亲和力结果较高（FI>1）；P148和P581与HLA-A*0201的复合物稳定性最好（DC50>6h）；P138、P345和P721这3条肽的稳定性结果DC50>4h，P129则稳定性一般；两条4位pSer的修饰肽与原肽相比，结合力提高了，尤其是P129-4（pSer）/HLA-A*0201的DC50得到明显改善。3. ELISPOT和ICS实验检测CTNNA2原肽及磷酸化肽体外诱导特异性CTLs的能力。除P345外，P129、P138、P148、P581和P721这5条肽效果明显。其中P138、P581和P721在这两实验中的结果都非常明显；ICS实验结果显示P129-4（pSer）和P148-4（pSer）肽特异性的CTL能分泌大量的IFN-γ，但在ELISPOT实验中，相比原肽它们的结果较明显。4. LDH释放及CFSE染色等细胞毒活性检测实验中，所有的CTNNA2候选短肽及磷酸化肽所刺激产生的特异性CTLs对MCF-7、MDA-MB-231及荷肽的T2A2均有杀伤，尤其是P138、P581和P721这3条肽的杀伤结果均较高，可达到40%左右。结论1. CTNNA2表位肽P129、P138、P148、P345、P581和P721均显示出了较强的结合力和稳定性。其中P129-4（pSer）和P148-4（pSer）两条修饰肽与HLA-A*0201的结合力、稳定性均明显优于原肽。2.不同健康者来源的外周血单核细胞，经体外诱导得到CTLs，通过ELISPOT和ICS实验显示P129、P138、P148、P581和P721能刺激产生一定数量的、释放IFN-γ的肽特异性CTLs。3. LDH释放实验显示P138、P581和P721所诱导的CTL能杀伤表达CTNNA2的乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231，并且具有一定的HLA限制性。4. CFSE实验结果显示P138、P129、P581和P721的杀伤率较高。5.综上所述，癌/睾丸抗原CTNNA2候选短肽P129、P138、P148、P581和P721可能是抗原的HLA-A2限制性CTL表位；磷酸化的引入能增强表位P129-4（pSer）和P148-4（pSer）的结合力及稳定性。