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恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的一类疾病，恶性肿瘤的发生、发展是多步骤、多因素参与的过程，其本质体现在基因水平的变化，如原癌基因的异常活化和（或）抑癌基因失活和缺失及其引起相关蛋白产物的变化，相应的引起了细胞出现持续性分化，自主性增殖，凋亡受限等最终导致肿瘤的发生及侵袭、转移的出现。而研究发现超过50%的原癌基因及抑癌基因产物均有蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases，PTKs)活性，近些年研究较多的脾酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase，Syk)是Syk基因的蛋白产物，属一种非受体型蛋白酪氨酸激酶，其转录过程选择性拼接可出现二种异构体，即全长型Syk(L)和缩短型Syk(S)，二者在DEL功能域上相差了23个氨基酸，故其在功能上也存在差异，国内外研究发现Syk(L)在乳腺癌、胃癌、肺癌、肝癌等多种腺上皮来源的肿瘤生长和转移起抑制作用，对于其作用机制及作为治疗靶点的体外研究也也越来越清晰。但对于缩短型Syk(S)，有学者认为其可能发挥癌基因功能，目前对其研究较少，更是缺乏Syk(S)在肿瘤中作用机制研究。目的：本实验拟通过质粒转染建立稳定表达Syk(S)的乳腺癌细胞株，并初步探讨Syk(S)基因对乳腺癌细胞增殖功能的影响。方法：1Syk(S)基因重组质粒的扩增及质粒稳定转染Syk阴性表达乳腺癌MDA-MB-231细胞株的建立1.1质粒扩增及细胞稳定转染：将携带Syk(S)基因的质粒转化至DH5α大肠杆菌中进行扩增，并使用脂质体法将携带Syk(S)基因的质粒转染至Syk阴性表达的乳腺癌MDA-MB-231细胞系，经G418筛选获得基因稳定表达的乳腺癌细胞株（MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)）。并以Syk基因阳性表达的乳腺癌细胞MCF7作为阳性对照，以转染空载体的乳腺癌细胞（MDA-MB-231pcDNA3.1）及未转染的乳腺癌细胞MDA-MB-231作为阴性对照。1.2稳定转染细胞株的验证：实验分组：对照组：人乳腺癌MDA-MB-231细胞和转染空载体MDA-MB-231pcDNA3.1细胞；实验组：MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)细胞。采用免疫组化验证Syk(S)蛋白的表达；并对转染细胞株进行连续传代，传至第四代，同时对每代细胞进行蛋白提取，冻存。最后用Western-blot方法检测各代稳定转染的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)中Syk(S)蛋白的表达。2MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)的增殖及凋亡的变化2.1实验分组：对照组：人乳腺癌MDA-MB-231细胞和转染空载MDA-MB-231pcDNA3.1细胞；实验组：MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)细胞。2.2应用流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞、MDA-MB-231pcDNA3.1细胞、MDA-MB-231pcDNA3.1-Syk(S)细胞周期及凋亡情况，比较稳定转染后MDA-MB-231细胞周期与凋亡的变化，探讨Syk(S)对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响。结果：1成功将Syk(S)质粒扩增并转染至乳腺癌细胞，形成MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)细胞，将MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)细胞经抗生素G418(400μg/mL)筛选，扩增,挑克隆,得到20株Syk(S)基因稳定转染的克隆。细胞形态无明显改变。2免疫组化检测结果显示：应用抗Syk多克隆抗体结果提示：稳定转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)显示胞浆棕黄色颗粒，MDA-MB-231pcDNA3.1及MDA-MB-231细胞胞浆、胞核均未见显色；阳性对照乳腺癌细胞MCF7胞浆、胞核均可见棕黄色颗粒。应用抗Syk(L)单克隆抗体结果显示： MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)及MDA-MB-231pcDNA3.1细胞胞浆、胞核均未见染色，与预期结果一致，证明转染成功。3Western-blot检测结果显示： Ⅰ-Ⅳ代转染细胞株MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)中Syk(S)蛋白表达量稳定且基本一致，而对照组MDA-MB-231pcDNA3.1细胞不表达Syk(S)蛋白，证明该稳定转染细胞株构建成功。4流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示：实验组：MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)细胞凋亡率（A）0.35士0.32%小于对照组：MDA-MB-231pcDNA3.1细胞（B）2.54士1.10%和MDA-MB-231细胞（C）3.32士1.63%细胞凋亡率，差异有统计学意义（P＜0.05）。5流式细胞仪检测细胞周期结果显示：实验组：MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)细胞中，29.77%的细胞处在G0/G1期，43.72%的细胞处在S期，而在对照组：MDA-MB-231pcDNA3.1细胞中，39.73%的细胞处在G0/G1期，仅有25.53%处在S期和MDA-MB-231细胞中38.93%的细胞处在G0/G1期，21.23%处在S期，说明转染Syk(S)后细胞G0/G1期比例显著减低，S期比例明显升高，差别有统计学意义（P＜0.05）；三组间G2/M期比例无显著性差异（P＞0.05）。结论：1成功建立了稳定表达Syk(S)蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231pcDNA3.1/Syk(S)细胞株。2Syk(S)表达通过促进G0/G1期向S期过渡使细胞增殖增加，同时抑制细胞凋亡从而促进乳腺癌细胞生长而发挥其癌基因功能。