论文部分内容阅读
目的建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型,通过TTC染色观察不同实验组动物模型脑梗死体积变化,TUNEL检测各实验组不同时间点凋亡细胞数,Western Blot检测Cathepsin B、Caspase-8、Caspase-3在不同时间点蛋白的表达水平,通过分析其各种蛋白表达水平的变化规律,判断Cathepsin B与Caspase-8-Caspase-3信号通路之间的关系。使用Cathepsin B、caspase-8特异性抑制剂进行干预,从而推断Cathepsin B与Caspase-8-Caspase-3信号通路之间可能存在的关系。通过电镜酶组织细胞化学法观察各信号通路关键蛋白的特异性抑制剂干预前后的各个时相溶酶体超微结构变化,进一步从微观方面探讨Cathepsin B与Caspase-8-Caspase-3信号通路和溶酶体之间相互关系。探讨Cathepsin B介导的细胞凋亡与Caspase-8-Caspase-3凋亡信号通路在神经细胞凋亡中的相互关系。方法本实验选用健康清洁级雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠制备MCAO模型,共成功造模262只,鼠龄10~12周左右,体重约240~280g。采用完全随机设计,随机将大鼠分为四大组:将大鼠分为脑缺血再灌注组(简称模型组,IRI组82只)及假手术组(16只),抑制剂CA-074Me组(简称CBI组82只),抑制剂Z-IETD-FMK(简称C8I组82只),以上四组大鼠按再灌注后0min、15min、30min、2h、6h、12h及24h再分成7个亚组(除24h时间点为16只大鼠外,其余每个时间点亚组为11只)。假手术对照组除了插线较短,不阻塞右侧大脑中动脉外,其他手术流程与其他三组一样。本实验使用改良Longa线栓法制备右侧大脑中动脉局灶性梗死模型(MCAO),选择在大鼠脑缺血2h后拔除线栓,形成再灌注模型。CBI组(cathepsin B抑制剂组)与C8I组(caspase-8抑制剂组)分别采用侧脑室穿刺法注射Cathepsin B特异性抑制剂CA-074Me及Caspase-8蛋白抑制剂Z-IETD-FMK(将CA-074Me 10μg溶于5μlDMSO中,于制作MCAO模型前60min注射入大鼠右侧侧脑室中,防止溶液漏出需留针10min;Z-IETD-FMK:0.5μg溶于5μlDMSO中,于制备MCAO模型前30min注射入大鼠右侧侧脑室中,同样留针10min,为避免DMSO溶液及侧脑室穿刺损伤造成实验误差,假手术组与模型组需要在相同时间点与相同部位注射相等剂量的DMSO溶液。本实验于再灌注后0min、15min、30min、2h、6h、12h及24h处死动物,以Longa’s的5级标准评分法评价大鼠不同时间点的神经功能缺损;sham组、IRI组、CBI组、C8I组均需取5只缺血再灌注后24h大鼠行TTC检测,观察大鼠脑缺血梗死体积的大小;TUNEL法检测不同组别在7个时间点神经细胞凋亡数目;Western Blot法测Cathepsin B、Caspase-8和Caspase-3在不同时间点蛋白的表达水平,通过分析其各种蛋白表达水平的变化规律,判断Cathepsin B与各信号通路之间的关系;通过电镜酶组织细胞化学法观察各信号通路关键蛋白的特异性抑制剂干预前后的各个时相溶酶体超微结构变化,进一步从微观方面探讨各信号通路和溶酶体之间相互关系。结果1.MCAO模型造模成功率为90.03%。2.TTC染色检测大鼠大脑缺血再灌注24h后的梗死灶时发现,模型组、CBI组、C8I组的24h相对梗死体积分别为37.54±0.86%、23.10±1.01%、29.8±0.94%。Sham组未见明显白色梗死灶,IRI组、CBI组、C8I组的白色缺血梗死灶均比Sham组明显增多,同时CBI组和C8I组的梗死灶体积较IRI组要明显减少(P<0.05),差异具统计学意义。MCAO模型神经功能缺损评分结果与大鼠脑梗死体积一致,IRI组、CBI组、C8I组均出现神经功能缺损症状,但CBI组、C8I组大鼠较IRI组的神经功能缺损症状与体征均有明显改善,差异具统计学意义(P<0.05)。3.使用TUNEL检测脑缺血再灌注损伤后大脑皮质区神经细胞凋亡数目,在Sham组中仅见极少数凋亡细胞,IRI组较Sham组凋亡细胞明显增多,0min开始出现凋亡细胞,随着时间的延长,凋亡数目逐渐增多,24h时凋亡细胞数目最多,CBI组与C8I组与IRI组一样,0min、15min、30min、2h、6h、12h、24h时间点的凋亡细胞数目呈增长趋势,但两抑制剂组的凋亡细胞数目与IRI组在同一时间点相比较明显减少(P<0.05),差异具统计学意义。4.使用Western blotting法检测脑缺血侧大脑中cathepsin B、caspase-8、caspase-3三种蛋白的表达量及表达变化趋势,三种蛋白在sham组中仅能检测到极少量的表达,IRI组上述三种蛋白的表达水平较高,与sham组有明显的统计学差异。Cathepsin B在IRI组中从0min开始检测到表达,15min达小高峰之后表达水平下降,2h后表达又逐渐升高,6h达最高峰,之后呈下降趋势,但24h仍有较高的表达。Cathepsin B在C8I组中的表达趋势与IRI组一致,在C8I组中各个相同时间点与IRI组比较没有明显的变化,差异不具有统计学意义。CBI抑制组中cathepsin B蛋白表达高峰出现在15min,之后到24h各个时间点的表达呈下降趋势,其表达量在各个相同时间点较模型组明显减少(P<0.05),差异具有统计学意义。IRI组中0min可以检测到caspase-8的表达,表达量逐渐增加,30min达高峰,之后表达量逐渐减少,但24h仍有较高的蛋白表达量,CBI组和C8I组的表达趋势同IRI组,但两干预组在各个相同时间点与IRI组的caspase-8的表达量相比较,均有明显的减少,差异有统计学意义(P<0.05)。caspase-3在IRI组中从0min开始表达,之后蛋白表达量逐渐升高,6h达顶峰,之后开始下降,在24h仍有较高的表达。Caspase-3在CBI组与C8I组中的表达趋势与IRI组一致,caspase-3在CBI组、C8I组中各个相同时间点的表达水平与IRI组相比较均明显减少(P<0.05),差异具有统计学意义。5.在大鼠缺血侧视前区使用电镜观察溶酶体的微观结构变化,sham组极少见到凋亡细胞,IRI组中随着时间的延长,电镜下溶酶体及次级溶酶体的数量也逐渐增多,细胞逐渐出现染色质致密及固缩边集、胞核固缩、破裂等细胞凋亡现象。CBI组与C8I组镜下所见与IRI组大致相似,但两干预组在相同时间点与IRI相比较,细胞凋亡现象减少,初级溶酶体与次级溶酶体数量也明显减少。结论1.大鼠脑缺血再灌注损伤后,脑缺血半暗带Cathepsin B与Caspase-8、Caspase-3的表达具有一定相关性,Cathepsin B可能通过caspase-8-caspase-3信号通路介导的细胞凋亡。2.抑制剂CA-074Me可能通过抑制Cathepsin B的表达,从而抑制其介导的一系列凋亡反应,减少缺血再灌注损伤引起的神经细胞凋亡,减少缺血梗死灶的体积,发挥其神经保护作用。3.抑制剂Z-IETD-FMK可能通过抑制caspase-8的表达,从而抑制其介导的一系列蛋白水解凋亡反应,减少缺血再灌注损伤引起的神经细胞凋亡,减少缺血梗死灶的体积,发挥其神经保护作用。