细小病毒是一组无囊膜,线状,裂解性的DNA病毒,它们对转化细胞具有杀伤效应而对相应的非转化细胞则无害,是基因治疗的候选载体。因此揭示细小病毒-宿主相互作用的机制尤为重要。前人的研究已识别了不少在细小病毒生活史中必需的或有助于病毒增殖的细胞因子,也认识了病毒蛋白在宿主细胞中的部分作用。但细小病毒对宿主细胞分子的全面影响至今尚未被认识。 肝癌是中国和南亚地区最常见的疾病之一。几株肝癌细胞系和细小病毒H-1的相互关系已在以往的工作中进行过研究,其中肝癌细胞系QGY-7703是研究最为深入的一个。为了了解细小病毒感染后细胞在转录水平上的全面反应以及病毒可能的细胞靶因子,以QGY-7703-H-1作为一个模型系统,采用了能同时监测上千基因表达变化的基因芯片技术,以期识别和细小病毒-宿主相互作用机制有关的细胞靶因子基因及其可能参与的途径。 细小病毒的复制紧紧依赖于和增殖及分化有关的细胞因子,尤其是和细胞周期S-期有关的因子。反过来,病毒的增殖又使细胞周期停滞在S/G2期。为了提高细胞群中表达病毒基因组细胞的比例同时减少病毒对细胞周期的干扰使样品产生的差异,采用同步化的细胞进行实验。试验了血清饥饿法,异亮氨酸饥饿法,药物阻断法,以及异亮氨酸饥饿结合药物阻断等多种方法,发现草氨酸处理法既简便又能获得所需的高度同步化的细胞群。草氨酸处理使细胞周期被阻滞在G1末期,药物释放后细胞能同步化地经过一个周期。 细胞在该药物存在下被病毒感染。对感染后不同时间的同步化细胞的死亡率,病毒的复制情况进行了监测,结果表明在细胞周期阻滞释放后,NS1蛋白及其mRNA的量随时间的增加而增加,细胞死亡率在释放12小时之前很低但之后也随时间而增加。细胞仍同步地处于同一细胞周期阶段,NS1表达较高,而细胞死亡率仍较低的两个时间点(释放后6小时和12小时)被选择进行芯片实验。 用代表22,000个人类基因的寡聚核苷酸芯片(Genechip Human Genome U133A,Aflymetrix)对这两个时间点的基因表达谱进行了研究。为了保证实验结果的可靠性,对实验样品的质量主要是实验不同阶段RNA的完整性进行了多步骤的监测,表明各个步骤样品均具有很高的质量。芯片实验的重复次数为两次,两次独立而重复芯片实验在6小时时间点的相关系数(coefficient correlation)分别为0.994(病毒感染1vs病毒感染2)和0.994(对照1vs对照2),在12小时时间点的相关系数分别为0.980(病毒感染1vs病毒感染2)和0.975(对照1vs对照2),