肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells, CSCs）是肿瘤组织中一群少量、具有无限自我更新能力、能分化产生异质性肿瘤细胞群的细胞。众多研究表明，肿瘤干细胞是肿瘤复发、转移的潜在根源，已成为肿瘤靶向治疗的一个重要对象。然而，肿瘤干细胞一般处于静息期，对小分子靶向药物不敏感；常用病毒载体（如慢病毒载体、逆转录病毒载体）对其感染效率不高，导致针对CSCs的基因治疗方案疗效不足。因而，仍需探索新的治疗方法，提高对肿瘤干细胞的治疗效果。近年来，免疫疗法在肿瘤临床治疗中获得巨大的成功，被Science杂志列为2013年最值得关注的六大科学领域之一。然而，肿瘤干细胞本身抗原递呈弱，无法激起有效的免疫反应。因而，为建立有效的针对肿瘤干细胞免疫治疗方案，亟需结合其它治疗手段，增强CSCs对免疫细胞的敏感性。溶瘤腺病毒（Oncolytic Adenovirus）能有效感染处于静止期的细胞，介导外源治疗基因的高效表达；同时，其本身具有裂解杀伤肿瘤细胞的能力，裂解细胞后释放的抗原能诱导产生强烈的免疫反应。P53蛋白具有促进细胞凋亡、衰老的作用，能间接激活免疫反应；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF）能诱导巨噬细胞、树突状细胞（Dendritic Cell, DC）的分化成熟，增强免疫反应。因而，如能联合溶瘤腺病毒、P53、GM-CSF三重免疫增强作用，有望建立针对肿瘤干细胞的有效治疗方案。基于以上考虑，在本研究中，我们利用溶瘤腺病毒携带11R-P53（融合11R穿膜肽的P53蛋白）与GM-CSF基因，构建共表达P53与GM-CSF的重组腺病毒SG655-GMP，并考察SG655-GMP对人肝癌干细胞体外模型，小鼠畸胎瘤干细胞体内模型的治疗效果。主要方法与结果如下：一、SG655-mGMP及相关对照病毒的构建与制备通过分子克隆技术构建溶瘤腺病毒穿梭质粒P74-Tp-mGM-CSF，与腺病毒骨架质粒pPE3-11R-P53进行腺病毒重组包装，构建获得SG655-mGMP。PCR方法验证病毒包装正确； Western Blotting实验表明病毒能有效表达治疗基因P53；ELISA实验表明病毒能有效表达mGM-CSF蛋白。二、SG655-mGMP对肿瘤干细胞的体外作用研究1.穿膜肽11R能增强腺病毒对肿瘤干细胞的体外感染效率荧光显微镜观察及流式检测均表明，相对于对照病毒，携带穿膜肽11R的溶瘤腺病毒对Hep3B来源肿瘤干细胞（Hep3B-C）及C57BL/6小鼠畸胎瘤干细胞株（ECCG5）的感染效率有效增强。2.腺病毒有效介导治疗基因在肿瘤干细胞内表达病毒感染Hep3B-C后（MOI=10）， Western Blotting显示P53蛋白能在细胞内有效表达；ELISA实验表明，细胞外上清中可检测到mGM-CSF的表达，且随感染复数增加表达量也增加。3. SG655-mGMP有效抑制肿瘤干细胞的生长病毒感染Hep3B-C，小鼠畸胎瘤干细胞后（MOI=10），CCK-8实验结果表明，病毒能有效抑制细胞的生长；携带11R的溶瘤腺病毒的抑制率高于未携带11R的溶瘤病毒。4. SG655-mGMP有效促进肿瘤干细胞的凋亡病毒感染Hep3B-C后（MOI=5），Annexin FITC/PI双染流式凋亡检测表明，病毒能有效诱导Hep3B-C的凋亡（凋亡率12.5%），凋亡率显著高于空白对照（0.2%），野生型腺病毒（6.0%），未携带11R的溶瘤腺病毒（7.7%）。三、SG655-mGMP激活免疫，抑制畸胎瘤干细胞移植瘤的生长通过对免疫正常的C57BL/6小鼠皮下接种C57BL/6小鼠畸胎瘤干细胞株（ECCG5），成功建立小鼠移植瘤模型；1.相对于对照病毒，溶瘤腺病毒SG655-mGMP能有效抑制移植瘤的生长；2. HE染色表明，病毒治疗后肿瘤组织中坏死斑有效增加；免疫组化结果显示（AIF1抗体），肿瘤组织中免疫浸润细胞显著增加；3.流式细胞检测表明， SG655-mGMP治疗后，肿瘤组织中巨噬细胞、DC细胞显著增加（GM-CSF发挥主要作用）；粒细胞、NK细胞无明显变化；T细胞少量增加（P53发挥主要作用）。以上结果表明， SG655-mGMP能有效感染肿瘤干细胞，并介导外源治疗基因P53与GM-CSF的表达；体外促进肿瘤干细胞的凋亡，抑制细胞生长；体内抑制肿瘤干细胞移植瘤的生长，并有效激活免疫反应，为建立靶向肿瘤干细胞的治疗提供新的策略。