目前,癌症的主要治疗手段以手术、放疗以及化疗三种方式为主,随着分子生物学技术的进展,生物治疗开始逐渐受到广泛的关注。生物治疗的广义概念指的是应用生物大分子进行治疗的方法,其毒副作用小、特异性强。在诸多的肿瘤生物疗法中,常见的疗法包括基因治疗以及蛋白质治疗。基因治疗指的是将外源基因导入到特定的细胞中,用来纠正或者补偿由于基因缺陷和异常引发的病症,从而达到疾病治疗目的的技术手段。要针对疾病实现良好的基因治疗效果,基因靶点的选择起着决定性作用,婆罗树样基因4（SALL4）是维持胚胎干细胞的自我更新和多能性等方面有着重要作用的转录因子,其通常只在胚胎阶段表达,在已经分化成熟的组织细胞中是低表达或沉默的。研究表明SALL4的异常高表达与肿瘤的发生发展有着直接的联系,通过基因治疗手段降低SALL4的表达水平,有望在基因水平抑制肿瘤的发生与发展。在常见的基因治疗手段中,脱氧核酶被证实能够有效地催化胞内特定m RNA的断裂,在转录后水平实现高效的基因敲除。然而,脱氧核酶本身不具备入胞能力,在体内容易被清除,体内半衰期短。因此,构建高效、安全的递送载体,实现靶向SALL4基因脱氧核酶的递送,对于实现基于脱氧核酶的乳腺癌基因治疗具有至关重要的意义。蛋白质治疗是一种将具有生物效应的蛋白质靶向递送至病变的组织或者细胞中,取代功能丧失或者表达能力低甚至丢失的蛋白质,从而实现疾病治疗效果的技术。蛋白质治疗因其诸多优点在癌症治疗领域引起了广泛的关注,研究表明,通过将促凋亡蛋白递送进入到肿瘤细胞中,能够有效地诱导肿瘤细胞的凋亡。细胞色素c是细胞线粒体凋亡途径中的关键起始蛋白,将细胞色素c递送至肿瘤细胞中,能够激活线粒体凋亡途径,高效地诱导肿瘤细胞的凋亡,从而达到良好的肿瘤抑制效果。然而,细胞色素c本身不具备入胞的能力,其正电荷性质也限制了细胞色素c在血液中的循环,因此构建理想的载体,对于实现细胞色素c的体内循环及胞内递送至关重要。非病毒类载体,比如脂质体、聚合物以及纳米颗粒,是小核酸分子以及蛋白质常用的递送载体。然而,上述载体仍有诸多缺点,如电荷密度过大导致的免疫原性、细胞毒性以及较短的循环半衰期等。外泌体是细胞分泌的具有膜结构的细胞外囊泡,其粒径为30-150 nm,是细胞之间转运生物大分子如核酸和蛋白质的天然载体。外泌体的内源性、纳米尺寸、循环稳定性和先天的生物相容性,使其在生物大分子递送方面具有得天独厚的优势。因此,外泌体有望成为一类良好的递送载体,实现脱氧核酶及细胞色素c的递送,发挥上述酶分子在肿瘤治疗中的作用。本论文的主要研究内容及结果如下:1.外泌体为载体介导脱氧核酶递送治疗乳腺癌的研究具有催化活性的脱氧核酶是目前有效的基因治疗手段之一。10-23型脱氧核酶是基因治疗中常用的脱氧核酶类型,其既具有催化RNA底物裂解的能力,同时又兼具设计的灵活性,在基因治疗领域有着广阔的应用前景。然而,脱氧核酶自身不能入胞,在体内缺乏靶向性,因此其应用也受到了限制。本研究中,我们以HEK-293来源的外泌体作为载体,实现课题组前期设计的靶向SALL4基因脱氧核酶Dz-SALL4的担载,构建了Dz-SALL4@Exo纳米复合物,以MCF-7细胞及荷瘤裸鼠为模型,对该纳米复合物的抗肿瘤效果及作用机制进行了系统的研究。RT-PCR和western blot分析表明,靶向SALL4基因的Dz-SALL4能够在m RNA和蛋白质水平上降低靶基因的表达水平;激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分析表明,外泌体能够有效介导Dz-SALL4在MCF-7细胞中的转染;MTT实验以及细胞集落形成研究表明,Dz-SALL4@Exo能够有效抑制MCF-7细胞的增殖,原因在于脱氧核酶能够诱导肿瘤细胞凋亡和周期阻滞效应;划痕实验及Transwell实验证明,Dz-SALL4@Exo有效地抑制了MCF-7细胞的迁移和侵袭。最后,纳米复合物Dz-SALL4@Exo在荷瘤裸鼠模型中明显抑制了肿瘤的生长,取得了与化疗药物阿霉素几乎一致的作用效果,这归功于外泌体介导脱氧核酶在肿瘤组织中的高效富集。以上结果表明,外泌体能够实现脱氧核酶的有效担载,脱氧核酶作为具有催化功能的核酸分子,递送入胞后能够催化目标m RNA的降解,实现对靶基因表达水平的调控,达到恶性肿瘤基因治疗的目的。2.外泌体为载体介导细胞色素c递送治疗乳腺癌的研究细胞色素c是一类重要的细胞凋亡蛋白,在肿瘤蛋白质治疗领域,其作为高效的模式凋亡蛋白而受到关注,其促凋亡作用的发挥依赖于高效的递送载体。肿瘤外泌体是肿瘤细胞分泌的外泌体,具有和肿瘤细胞相似的分子组成,研究证实肿瘤外泌体具有“归巢属性”,能够靶向于其来源的细胞系,有望作为蛋白质的高效递送载体应用于抗肿瘤研究。本研究中,我们以乳腺癌细胞系MCF-7来源的外泌体为载体,以促凋亡蛋白细胞色素c为模式蛋白,通过物理挤出联合皂素孵育的方法构建Cyt c@Exo纳米复合物。通过Western blot以及荧光标记的方法证实了细胞色素c在外泌体中的成功装载;以MCF-7为模型,证明Cyt c@Exo纳米复合物的高效入胞能力,同时系统地证明其能够诱导MCF-7细胞增殖抑制以及凋亡等细胞学效应,并对相关机制进行了深入探究;以荷瘤裸鼠为模型,系统评价了我们所构建的纳米复合物的抗肿瘤效果及肿瘤靶向能力与机制。综上,本研究基于天然来源的外泌体,构建了一类具有良好递送效率和生物相容性的载体,成功实现了具有抗肿瘤作用功能酶分子——脱氧核酶及细胞色素c的组装与递送,在细胞与动物水平均取得了良好的抗肿瘤效果。以上研究,为基于外泌体构建抗肿瘤基因及蛋白质递送体系提供了新的思路,同时也为认识外泌体在肿瘤细胞间的信号传递以及肿瘤发生、转移机制等搭建了良好的平台。