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氨基葡萄糖(Glucosamine, GlcN)又称氨基葡糖或葡糖胺，是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物，在医药、食品和保健领域具有广泛应用。本论文以大肠杆菌Escherichia coli ATCC25947(DE3)为出发菌株，通过将来自大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶基因glmS和来自酿酒酵母Saccharomycescerevisiae S288C氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1插入原核表达载体pET28(a)中，构建重组质粒pET28(a)-glmS-gna1，转化大肠杆菌E. coli ATCC25947(DE3)，得到重组菌E. coli-glmS-gna1；对发酵过程中葡萄糖不同流加方式和溶氧水平控制进行了研究，在此基础上提出了两种发酵控制策略：葡萄糖分阶段流加策略和分阶段的溶氧控制策略，有效地提高了重组菌生产氨基葡萄糖的产量；利用Red同源重组技术分别敲除细胞用于转运氨基葡萄糖的甘露糖磷酸转运子编码基因manX、葡萄糖磷酸转运子编码基因ptsG以及乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)转运子编码基因nagE；在对工程菌相关基因转录水平结果分析的基础上敲除了工程菌丙酮酸激酶基因pykA和pykF，进一步提高了氨基葡萄糖的产量。论文主要研究结果如下：1)通过将来自大肠杆菌glmS基因和来自酿酒酵母S. cerevisiae S288C的gna1基因插入原核表达载体pET28(a)中，构建重组质粒pET28(a)-glmS-gna1，转化大肠杆菌E. coli ATCC25947(DE3)，得到工程菌E. coli-glmS-gna1，在乳糖诱导下，glmS基因和gna1基因过量表达，经过对培养条件的优化，重组菌氨基葡萄糖总产量在18h达到最高值24.15g/L，较出发菌株提高1.97倍。2)在3-L发酵罐中对E. coli-glmS-gna1发酵时葡萄糖不同流加方式，包括恒速流加、间歇流加以及指数流加进行了研究，结果显示，指数流加方式下细胞比生长速率较高而乙酸浓度较低，而恒速流加方式下氨基葡萄糖的比生产速率较高，由此提出了葡萄糖分阶段流加策略：0-2h，不流加；2-10h，控制μ=0.2指数流加；10-16h，恒速流加，在此条件下，氨糖总产量最高值达到69.66g/L，较对照提高了1.59倍。3)在3-L发酵罐中研究了E. coli-glmS-gna1发酵过程中不同溶解氧水平(10、20、30、40%)对氨基葡萄糖生产的影响，结果显示：在发酵过程的不同阶段，氨基葡萄糖的合成对溶解氧的水平要求不同，即在0-2h，氨基葡萄糖比生产速率在溶氧浓度为20%时最高；在2-8h，氨基葡萄糖比生产速率在溶氧浓度为30%时最高；在8-12h，氨基葡萄糖比生产速率在溶氧浓度40%时最高；在12-18h，氨基葡萄糖比生产速率在溶氧浓度30%时最高。提出了分阶段溶氧控制策略：0-2h，DO20%；2-8h，DO30%；8-12h，DO40%；12-18h，DO30%，在此条件下氨糖最高产量达到72.89g/L，氨糖总产量比不进行溶氧控制下(53.31g/L)提高1.37倍。4)利用Red同源重组技术将E. coli-glmS-gna1的乙酰氨基葡萄糖磷酸转运子编码基因nagE和甘露糖磷酸转运子编码基因manX敲除，获得nagE单基因敲除的工程菌E. coli-glmS-gna1-nagE和nagE/manX双基因敲除的工程菌E. coli-glmS-gna1-nagE-manX，并在7-L发酵罐进行发酵，单基因敲除菌株E. coli-glmS-gna1-nagE至12h时GlcN产量达到最大值4.38g/L(是对照菌株的1.08倍)，GlcNAc产量达到最大值71.80g/L (是对照菌株的1.7倍)；培养双基因敲除菌株E. coli-glmS-gna1-nagE-manX至10h时GlcN产量达到最大值4.82g/L (是对照菌株的1.2倍)，GlcNAc产量达到最大值118.78g/L (是对照菌株的2.86倍)。5)利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌E. coli-glmS-gna1-nagE-manX菌株基因组ptsG基因，获得PTS缺陷菌株，同时分别利用质粒pETduet-1和pRSFduet-1过量表达葡萄糖激酶基因glk和半乳糖苷透性酶基因galP，使葡萄糖转运能力得到修复，得到E. coli-glmS-gna1-galP-glk-nagE-manX-ptsG。发酵结果显示：利用ptsG基因敲除菌株，发酵过程中葡萄糖浓度的下降以及氨基葡萄糖浓度的上升均较ptsG基因未敲除菌株发酵时变化缓慢；ptsG基因的敲除能减少发酵后期发酵液中氨基葡萄糖浓度的下降；相对于E. coli-glmS-gna1，由于PTS缺陷菌株葡萄糖吸收速率较慢，ptsG基因敲除的重组菌乙酸最高浓度降低了71%，GlcN和GlcNAc的产量分别增加97%和60%，GlcN和GlcNAc总产量增加65.4%，达到128.75g/L。6)利用Real-Time PCR对E. coli-glmS-gna1-galP-glk-nagE-manX-ptsG和E. coli-glmS-gna1-galP-glk菌株相关基因转录水平进行分析，结果显示：前者与氨基葡萄糖合成相关的基因glmS和gna1的转录水平均呈现上调变化，而糖酵解途经相关基因的转录水平均呈现下调变化。由此利用Red同源重组技术对丙酮酸激酶编码基因pykA和pykF分别进行敲除，得到pykA单基因缺失菌株E.coli-glmS-gna1-galP-glk-nagE-manX-ptsG-pykA、pykF单基因缺失菌株E. coli-glmS-gna1-galP-glk-nagE-manX-ptsG-pykF以及pykA和pykF双基因缺失菌株E. coli-glmS-gna1-galP-glk-nagE-manX-ptsG-pykA-pykF。发酵结果显示：pykA单基因敲除菌株和pykF单基因敲除菌株氨基葡萄糖总产量最高值较对照菌有所提高，分别达到130.19g/L和132.43g/L，而pykA/pykF双基因敲除菌株氨基葡萄糖总产量较对照菌下降61%。