BmAGO3zs表达研究及新型家蚕杆状病毒的构建

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从家蚕cDNA文库中筛选出一条序列(GenBank登录号:NM001104597.2),其开放阅读框大小为2781bp,编码由926个氨基酸残基组成的蛋白。生物信息学分析结果显示,编码的蛋白预测分子量大小为104.5kDa,等电点为9.0,与其它物种中argonaute3(AGO3)蛋白同源性很高,故将该基因命名为BmAGO3(Bombyx mori AGO3)。抗原表位分析获得BmAGO3蛋白的表面抗原区Kago-3,表达其表面抗原区Kago-3,用于抗体制备。Kago-3片段ORF框为702bp,编码234个氨基酸残基,预测分子量27.34kDa,等电点8.88。首先PCR扩增Kago-3片段并成功构建pET-28a(+)-(Kago-3)重组载体,转化E.coliBL21(DE3),诱导表达后经Western Blotting分析,在30kDa左右的位置出现一条特异性条带,与预期值30.9kDa(融合His标签为3.56kDa,kago-3为27.34kDa)相符。用Ni2+柱亲和层析法纯化得到的Kago-3融合蛋白,对新西兰雄兔进行免疫获得多克隆抗体,抗血清效价的ELISA检测结果达到1:51200。分别提取家蚕不同发育时期及五龄期不同组织总蛋白,Western Blotting检测BmAGO3基因在家蚕各发育时期和五龄期各组织的表达情况。结果表明,BmAGO3在家蚕卵、蛹、蛾与五龄幼虫期均有表达,但表达水平有差异,从高到低依次是:蛾、五龄蚕、蛹和卵。BmAGO3的表达差异性在五龄幼虫各组织中也很明显,在蚕血、头和皮中表达量较高,在脂肪体和气管中表达较少,在其它组织中没有检测到明显表达。由于AGO蛋白是miRNA功能途径的关键蛋白,因此,表达谱分析结果表明五龄幼虫蚕血、头和皮组织以及蛾期均有可能存在比较活跃的miRNA调控。亚细胞定位分析结果表明,BmAGO3蛋白主要分布在细胞质中,进一步RNA干扰下调BmAGO3在BmN细胞中的表达水平,MTT法检测RNA干扰前后细胞活力,分析表明,RNA干扰后,细胞活力上升。另外,为了研究家蚕杆状病毒侵染细胞的机制,本研究还构建了一个新型重组家蚕杆状病毒。运用重叠延伸PCR技术将EGFP和RFP基因分别与杆状病毒囊膜糖蛋白GP64基因和衣壳主要蛋白VP39基因串联起来,构建了一个能同时在杆状病毒囊膜展示绿色荧光蛋白,在核衣壳展示红色荧光蛋白的新型重组杆状病毒,为研究家蚕杆状病毒侵染机制和观察侵染路径提供了一个有力工具。同时该重组杆状病毒能同时在囊膜和衣壳表面展示两个蛋白,可以用于两个抗原蛋白的同时展示,从而用于多抗原伪病毒疫苗的研制。
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