结核病是伴随人类历史最长的传染性疾病之一,曾一度得到有效控制,但随着人们防患意识下降、不合理用药以及耐药菌株的出现,近20年来,结核发病率又出现上升趋势。2005年,世界卫生组织(WHO)在日内瓦举行的第八届结核病年会报告中指出:2003年以来,全球每年新增结核感染病例数已上升到880万,每年约有170万人死于结核病【1】。我国结核病例数居世界第二位,也是全球22个结核病高负担国家之一,卫生部公布全国法定传染病疫情报告显示,结核病已成为我国传染病第一杀手【2】。骨关节结核约占结核总发病率的3-5%【3】,肺外结核的35-50%,是发病率最高的肺外结核【4】。其特点是:发病呈不典型性和侵袭性,主要病理表现为骨质破坏,死骨形成;到了晚期,由于正常骨结构破坏,骨缺损形成,造成肢体畸形或截瘫,严重影响患者生活质量。骨移植是修复骨缺损的最佳方法,但由于局部病灶中残留结核病菌,往往会导致植骨失败。本文通过探讨骨关节结核的发病机制,在建立免疫性骨结核动物模型的基础上,研制出一种兼具抗结核能力和促成骨活性的植骨材料,为临床一期植骨,同时杀灭结核菌和修复骨缺损提供有效方法。第1部分:骨关节结核发病机制的研究目的:探讨骨关节结核骨质破坏的发病原因和病理机制。方法:1.建立体外破骨细胞培养体系,观察采用不同方法处理的结核因子对破骨细胞诱导和活化的影响;2.建立体外成骨细胞培养体系,观察采用不同方法处理的结核因子对成骨细胞数量和活性的影响;3.体内实验观察局部注射超声裂解制备的结核因子对小鼠颅骨骨质的影响。结果:1.超声裂解制备的结核因子能促进肿瘤坏死因子(TNF-α)的分泌,从而诱导破骨细胞形成和活化;2.超声裂解制备的结核因子对成骨细胞的形成和活力没有明显的抑制作用;3.局部注射超声裂解制备的结核因子,能引起小鼠颅骨轻度的骨质吸收和体内钙离子水平升高。结论:骨结核病理改变可能与结核因子激活体内炎症因子,诱导破骨细胞形成和活化,进而导致局部骨质破坏有关。第2部分:免疫性骨结核模型的建立目的:根据骨关节结核的发病机制,建立兔免疫性骨结核模型。方法:采用结核菌素纯化蛋白(PPD)试验阴性兔作为模型动物,先使用小剂量结核因子抗原致敏模型动物,再通过大剂量局部注射结核因子,引起迟发型超敏反应(DTH),造成局部骨质破坏,建立免疫性骨结核模型发生的变化,并分别从大体、X线片及组织学等方面观察和评价模型。结果:观察显示,结核因子注射部位出现干酪性坏死,破骨细胞数量增加,骨质破坏明显。结论:本动物模型能模拟骨结核的病理特点,具有有效替代结核活菌建模的应用价值。第3部分:抗结核骨的研制目的:研制兼具抗结核能力和促成骨活性的抗结核骨。方法:采用明胶和聚己内酯复合包裹法将异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇等4种抗结核药物按一定浓度和配比与重组合异种骨(RBX)复合,制备抗结核骨。通过小鼠肌袋实验,观察抗结核骨的诱导成骨活性,通过体内、体外药物释放实验,观察抗结核药物的释放特性。结果:抗结核骨能在肌肉内诱导成软骨和骨,抗结核药物的释放具有早期爆发、中期持续、药效长期的特点。采集不同时期抗结核骨释放的抗结核药物进行抑菌实验,发现28d时,所释放的抗结核药物仍然保持对结核杆菌的有效作用。结论:抗结核骨能在移植局部有效杀灭结核杆菌,并保留良好促成骨能力。第4部分:抗结核骨的治疗作用目的:观察抗结核骨对动物模型的治疗作用。方法:1.建立兔免疫性骨结核模型,进行病灶清除术后,在缺损部位一期植入抗结核骨,术后通过大体、放射学、血清学和组织学指标,观察抗结核骨对兔结核模型的治疗作用。2.建立兔桡骨临界缺损模型,将抗结核骨植入缺损部位,术后通过大体、放射学、血清学和组织学指标,观察抗结核骨对兔桡骨缺损模型的修复作用。结果:1.抗结核骨能有效修复病灶清除后遗留的骨缺损,并保持安全血药浓度;2.抗结核骨能有效修复桡骨临界骨缺损,并维持安全血药浓度。结论:抗结核骨对骨结核模型具有治疗作用,局部使用,全身安全。第5部分:抗结核药物对骨细胞的作用目的:观察抗结核骨中使用的抗结核药物对骨细胞的影响。方法:1.建立体外成骨细胞培养体系,分别加入不同浓度的抗结核药物,观察成骨细胞数量和活力变化;2.建立体外破骨细胞培养体系,分别加入不同浓度的抗结核药物或抗结核药物复合结核因子,观察破骨细胞数量和活力变化。结果:1.高浓度抗结核药物对成骨细胞的数量和功能具有抑制作用;2.单纯加入抗结核药物对破骨细胞的数量和功能没有明显抑制作用,当抗结核药物复合结核因子使用时,随着抗结核药物浓度增加,其对破骨细胞的抑制作用逐渐增强。结论:复合抗结核药物的抗结核骨局部使用时,对成骨细胞具有抑制作用,应注意局部使用时的药物剂量;抗结核药物可通过免疫调节机制抑制破骨细胞。本文首先探讨结核因子诱导破骨细胞生成和引起骨质破坏的作用;研制出抗结核骨并研究其生物活性和药物释放特性;克服了以往采用结核活菌建立动物模型的诸多不便,建立免疫性兔骨结核模型,提供了较理想的建模方法,并采用抗结核骨成功治疗结核模型;最后研究抗结核药物对骨细胞的作用。结果证明通过本实验建立的抗结核骨兼具良好促成骨能力和有效抗结核能力,且局部使用,实现了药物长期有效缓释,抑菌效果好,全身安全,具有良好的临床应用前景。